KIFC3在結腸癌中的表達及其對結腸癌細胞遷移和侵襲的影響

張 嵐，董衛國

武漢大學人民醫院消化內科，湖北 武漢 430060

結腸癌作為世界上第三大最常見的惡性腫瘤，對社會造成巨大的經濟負擔。盡管現代診療技術取得長足進步，但對于已經發生轉移的患者，往往治療效果欠佳[1-2]。驅動蛋白超家族(kinesin superfamily，KIFs)在人體中由45個家族成員組成，在腫瘤的發生、發展過程中發揮著不同的作用[3]。KIF21B參與非小細胞肺癌細胞遷移和侵襲，抑制KIF21B表達可顯著抑制裸鼠移植瘤生長[4]；KIF2A與KIF20A在多種癌癥中表達上調，且與腫瘤患者發生淋巴結轉移和遠處轉移密切相關[5]。KIF23、KIF20B及KIF15分別能夠通過刺激癌細胞增殖進而促進胃癌、腎透明細胞癌、舌癌和骨肉瘤進展[6-9]。然而，關于KIFC3在結腸癌中的表達及作用研究尚不足。本研究通過生物信息學方法對多種公共數據庫進行分析，探索KIFC3在結腸癌組織中的表達情況及其對結腸癌患者預后的影響，并分析KIFC3對結腸癌細胞遷移和侵襲的影響，為基礎和臨床研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑結腸癌細胞系SW480、DLD-1、HT29與HCT116和正常結腸上皮細胞NCM460由武漢大學人民醫院中心實驗室提供，DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司，KIFC3慢病毒感染液購自上海吉凱基因。Matrigel膠購自Invitrogen公司，Transwell小室購自Corning公司。KIFC3(10125-2-AP)、MMP2(10373-2-AP)、MMP9(10375-2-AP)、E-cadherin(20874-1-AP)、Snail(13099-1-AP)及GAPDH(10494-1-AP)抗體購自Proteintech公司。

1.2 細胞轉染實驗取對數生長期的細胞，使用胰酶消化后收集并接種在6孔板中，接種密度為5×104個/ml，于37 ℃和體積分數為5%的CO2培養箱中培養過夜。根據說明書的步驟，用干擾KIFC3基因的慢病毒感染SW480細胞，病毒載體為GV248，元件順序為hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin，克隆位點為AgeI/EcoRI，MOI與病毒滴度分別為100和2×109TU/ml，干擾序列與對照序列分別為CGCTCTATTCCCTCAAGTT和TTCTCCGAACGTGTCACGT，48 h后收集細胞并用于后續實驗。實驗分組為陰性對照組即NC組和干擾KIFC3表達組即sh-KIFC3組。

1.3 GEPIA與UALCAN數據庫在GEPIA數據庫基因欄輸入KIFC1/2/3，腫瘤樣本選擇食管癌、胃癌和結腸癌，分析KIFC1/2/3在腫瘤組織和正常組織中的差異表達和KIFC1/2/3表達水平與食管癌、胃癌和結腸癌患者總生存時間(overall survival，OS)、無病生存時間(disease free survival，DFS)的關系。在UALCAN數據庫基因欄輸入KIFC3，腫瘤樣本選擇結腸癌，分析KIFC3基于結腸癌分期、分型和淋巴結轉移的差異表達情況。

1.4 GO分析與KEGG富集分析在STRING數據庫基因欄輸入KIFC3，搜索與KIFC3存在共表達或相互作用的基因，建立蛋白互作網絡(protein-protein interaction，PPI)。在Cytoscape軟件中運用ClueGO插件對上述基因作GO分析與KEGG富集分析。

1.5 TIMER數據庫在TIMER數據庫基因欄輸入KIFC3，腫瘤樣本選擇結腸癌，分析KIFC3表達水平與常見細胞增殖、周期、遷移和侵襲分子標志物表達量的關系。

1.6 細胞遷移、侵襲實驗細胞遷移：胰酶消化細胞后收集并接種于6孔板中，待細胞長滿后丟棄培養基，用20 μl槍頭比著直尺在6孔板底部劃痕，PBS清洗3次棄去漂浮的細胞。加入2 ml無血清培養基后于培養箱培養，分別于培養后0、12、24、48 h觀察細胞遷移情況，并拍照。

細胞侵襲：將結腸癌細胞接種于載有Transwell小室的24孔板中，小室底部鋪有一層Matrigel膠。小室上室含有100 μl細胞懸液，下室中加入500 μl含質量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM培養基。培養箱中培養24 h后，用棉簽擦除上室的基質膠和細胞。多聚甲醛固定后，結晶紫染色，顯微鏡觀察并拍照。

1.7 Western blotting實驗RIPA裂解液冰上裂解細胞后提取蛋白，根據BCA試劑盒測定蛋白濃度。每孔50 μg行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜至PVDF膜后，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，Odyssey顯像并分析。

2 結果

2.1 KIFC1/2/3在消化道腫瘤中的表達通過GEPIA數據庫分析KIFC1/2/3在食管癌、胃癌和結腸癌組織中的表達情況，結果顯示，相比正常組織，KIFC1/2/3在腫瘤組織中的表達量均明顯增加(見圖1A)。Western blotting結果表明，相比NCM460細胞，結腸癌細胞系SW480、DLD-1、HT29與HCT116中KIFC3均表達上調(見圖1B～1C)。

2.2 KIFC3表達與結腸癌預后的關系通過GEPIA數據庫分析KIFC1/2/3對食管癌、胃癌和結腸癌患者預后的影響，結果顯示，KIFC3高表達影響結腸癌患者總生存期，但對無病生存期的影響差異無統計學意義；KIFC1和KIFC2對3種腫瘤患者生存時間的影響差異均無統計學意義(P>0.05)(見圖2)。由于KIFC1與KIFC2對3種消化道腫瘤的預后均無影響，因此本研究主要探討KIFC3在結腸癌組織中的表達及其對結腸癌細胞遷移和侵襲的影響。

注：*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001。

圖2 KIFC3表達與結腸癌預后的關系Fig 2 Relationship between KIFC3 expression and prognosis of colon cancer

2.3 KIFC3與結腸癌臨床特征相關性分析通過UALCAN數據庫分析KIFC3與結腸癌臨床特征的相關性，結果表明，KIFC3高表達與結腸癌分期和淋巴結轉移相關。此外，相比于結腸腺癌，結腸黏液性腺癌中KIFC3表達量更高(見圖3)。

2.4 KIFC3共表達與基因富集分析通過STRING數據庫分析與KIFC3存在相互作用或共表達的基因，結果顯示，KIFC3與CTNND1、CDH1、PRC1等基因存在相互作用或共表達。進一步利用Cytoscape軟件進行GO分析與KEGG富集分析，結果表明，KIFC3可能參與細胞間黏附和緊密連接的過程(見圖4)。

注：*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001。

圖4 KIFC3共表達基因及基因富集分析Fig 4 Coexpression gene and gene enrichment analysis of KIFC3

2.5 KIFC3與MMP2、MMP9表達的關系為了進一步驗證上述富集分析結果，我們利用TIMER數據庫分析KIFC3與常見細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關分子標志物表達量的關系。結果表明，KIFC3與MMP2和MMP9呈顯著正相關(見圖5)。

2.6 KIFC3對結腸癌細胞遷移和侵襲的影響細胞劃痕實驗與Transwell細胞侵襲實驗檢測KIFC3對結腸癌細胞SW480遷移與侵襲能力的影響。實驗結果表明，與NC組相比，sh-KIFC3組SW480細胞遷移、侵襲能力顯著下降。Western blotting結果顯示，sh-KIFC3組KIFC3、MMP2、MMP9和Snail蛋白表達下調，E-cadherin蛋白表達上調(見圖6)。

3 討論

腫瘤細胞的侵襲和轉移與患者的不良預后密切相關，尋找有效的治療靶點、扼制腫瘤細胞的侵襲和轉移，進而抑制腫瘤的發展是改善腫瘤患者預后的重要手段。驅動蛋白家族作為細胞內的一類馬達蛋白，主要參與細胞內物質運輸過程。驅動蛋白通過水解ATP獲取能量并驅動自身及所攜帶的貨物分子沿微管運動[10]。此外，在有絲分裂過程中，驅動蛋白也是染色體和紡錘體分離的重要參與者[11]。研究發現，過表達驅動蛋白家族成員(KIF1A、KIF5A、KIFC1和KIFC3)，

圖5 KIFC3與常見細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關分子標志物的關系Fig 5 Relationship between KIFC3 and common molecular markers of cell proliferation, apoptosis, migration and invasion

注：*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001。

乳腺癌細胞對多西他賽、紫杉醇耐藥性增強[12-13]，驅動蛋白抑制劑的開發有望提高乳腺癌化療的效果。KIFC3還被發現與肝細胞癌患者的不良預后有關，KIFC3高表達提示更短的生存時間，且KIFC3與肝細胞癌遷移和侵襲相關[14]?？梢?，KIFC3在部分腫瘤中可能扮演著癌基因的角色，抑制其表達有望降低腫瘤細胞轉移和耐藥。

本次研究利用GEPIA數據庫分析食管癌、胃癌和結腸癌組織與相應正常組織中KIFC1/2/3的表達情況，結果表明，相比于正常組織，KIFC1/2/3在腫瘤組織中呈高表達，且KIFC3高表達結腸癌患者的生存時間更短，提示KIFC3的高表達可能與結腸癌的發生、發展相關。為了探索KIFC3對結腸癌生物學行為的影響，我們進一步利用STRING數據庫分析與KIFC3相互作用或存在共表達現象的其他分子，并對相關分子做GO分析與KEGG富集分析。分析結果顯示，KIFC3可能影響細胞間黏附與緊密連接，這提示KIFC3對腫瘤細胞遷移和侵襲可能存在一定的作用。TIMER數據庫結果顯示，KIFC3與幾種常見細胞增殖和周期分子無相關性，但與MMP2和MMP9相關性顯著。MMP2與MMP9均為基質金屬蛋白酶家族成員，當被細胞外蛋白酶分解后發生激活，分解細胞外基質，參與腫瘤細胞的遷移和侵襲[15]。這與基因富集分析結果存在一致性，即KIFC3對腫瘤細胞轉移的潛在影響。EMT在結腸癌轉移過程中具有重要意義。EMT使得腫瘤細胞與基底膜和其他細胞之間的連接不再緊密，為腫瘤細胞進入循環系統播散至全身其他器官提供便利[16]。血清和糖皮質激素誘導蛋白激酶2(serum and glucocorticoid-inducible kinase 2，SGK2)在結腸癌中過表達，與EMT呈正相關[17]。天然化合物魚藤酮能夠抑制EMT，扼制結腸癌細胞增殖和遷移[18]。在本研究中，通過慢病毒干擾KIFC3表達，我們發現KIFC3能夠促進結腸癌細胞遷移與侵襲，且可能通過促進EMT實現。本次研究也存在一定的局限性，由于缺乏臨床結腸癌組織與癌旁組織樣本，KIFC3差異表達僅在細胞層面得到驗證，而其在結腸癌組織與癌旁組織的差異表達主要通過挖掘公共數據庫獲得。

總之，本次研究結果表明，KIFC3在結腸癌組織與細胞中高表達，可能通過促進EMT刺激結腸癌細胞的侵襲和遷移，影響結腸癌患者生存時間，有可能成為結腸癌治療的新靶點。