數字PCR技術在核酸標準物質研制中的應用

鄭子繁,柳方方,劉衛曉,金蕪軍,李亮

中國農業科學院生物技術研究所, 北京 100081

核酸的序列、多樣性和豐度分析是現代生物學的基礎。由于分子生物學技術的不斷發展，核酸定量技術已廣泛應用于生命科學領域，核酸定量技術也相應地更新換代：在傳統的定量PCR(quantitative PCR，qPCR)基礎上，數字PCR(digital PCR，dPCR)技術應運而生[1]。1992年，Sykes等[2]報道了巢式PCR定量技術，巢式PCR技術是基于樣品稀釋和泊松分布數據處理成立的,同時他還提出了數字PCR的構想。1997年，Kalinina等進行了微升(μL)級的PCR反應，使用毛細玻璃管作為反應器，通過熒光探針收集到基因組DNA的單分子信號，進而發展出了單分子定量技術[3]。1999年，Vogelstein和Kinzler[4]基于以上報道采用96孔板系統將PCR擴增方法發展到了微升級，并對結腸癌的致癌突變基因ras進行了定量分析。

早期數字PCR技術的反應單元使用的是96/384孔板[2]。由于數字PCR技術的反應單元數與靈敏度和準確度成正相關，因此需要找到比普通的96/384孔板更高精度的反應器才能滿足越發精密的檢測需要。為了提高精度，需要將反應單元數目成倍提高，因此反應體積從微升級精確到了納升級[3]，數字PCR技術也因此愈發成熟。

在許多診斷應用和常規實驗室測試中，能夠進行準確、可靠和可重復的核酸定量(DNA/RNA)是十分重要的[2]。為了準確地定量核酸，需要用已知測量不確定性的量的靶核酸序列(拷貝數或拷貝數濃度)作為標準物質[5]。標準物質(reference material，RM)是一種足夠均勻的，具有一種或多種相對容易確定的特性值的材料或物質，可用于給材料賦值、評價測量方法及校準測量儀器等[6]。標準物質具有通用屬性。標準物質可以用于定性檢測，也可以用于定量檢測。由于標準物質特性量值具有穩定性、均勻性和準確性，現已被越來越多地應用在分析測量、國內外貿易、環境保護、醫療衛生、工農業生產、國防建設以及人民生活等各個領域[7]。標準物質的分類方式多樣，按標準物質的應用領域，ISO/REMCO將標準物質分為17大類：地質學、核材料及放射性材料、有色金屬、塑料/橡膠/塑料制品、生物/植物/食品、臨床化學、石油、有機化工產品、物理學和計量學、物理化學、環境、黑色金屬、玻璃/陶瓷、生物醫學/藥物、紙、無機化工產品、技術和工程。核酸標準物質即為用于核酸擴增技術的標準物質，是生物標準物質的一種。生物標準物質擁有已知的生物含量、活性和特性測定的計量標準和溯源體系，使得各生產單位在進行產品的生產、研發和檢測時結果具有可比性。本文著重介紹了數字PCR的基本原理、類型，以及數字PCR目前在核酸標準物質研制中的應用進展,以期為核酸標準物質的研制提供參考。

1 數字PCR概述

目前，核酸定量的金標準是實時熒光定量PCR技術(qPCR)[5]。然而，這種定量方法需要將未知物與參考標準進行比較[8]，這意味著如果使用了不同的標準或校準物，不同實驗室之間得到的結果將很難進行對比。數字PCR是近些年的新興技術，無需外參曲線，能夠獨立精準地對未知物進行測量，目前已有很多文獻對其進行了報道。

1.1 數字PCR的原理

數字PCR的基本原理是將含有靶核酸、引物、探針和主混合物的反應混合物隨機分布到數百至數百萬個均勻大小的納升或皮升分區中，使得一些分區含有靶分子的復合物，單分子間通過稀釋被分離，在單個分區中獨自進行PCR擴增，最后分析每個擴增產物[9]。每個分區的DNA模板數少于或者等于1個，這樣經過PCR循環之后，有一個(或一個以上)DNA模板的分區是亮的，沒有DNA模板的分區就是暗的[10]，然后計算靶核酸拷貝數濃度。

數字PCR作為一種參考方法已在一些計量機構使用，這種方法能夠將拷貝數濃度聯系到標準物質[9,11-12]，將常規定量分子檢測中使用的校準物質追溯到國際單位制(SI)[13]。一項國際對比研究[14]表明，dPCR和qPCR結果之間具有極好的可比性，且dPCR具有更好的精確度。dPCR可以直接計數目標分子數量且不需依靠任何校準物或外標，只通過對單個分子計數就能實現絕對定量，因此有著相當的優勢。相較于qPCR而言，dPCR的關鍵特性列于表1。目前，dPCR逐漸應用在量化DNA靶標、稀有[10,15-16]病原體檢測[13,17]、病毒載量測試[18]、檢測食品中的轉基因成分[19]和大規模平行序列文庫的量化等方面。

1.2 數字PCR的分類

根據反應單元形成方式的不同，數字PCR可分為微滴、微流控芯片和微滴芯片式數字PCR等。

1.2.1微滴數字PCR 微滴數字PCR基于乳液PCR(emulsion PCR)技術[12-13]，是使用微滴發生器來一次生成數萬乃至數百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴，用這些很小的油包水微滴來作為數字PCR的樣品分散載體。通過油水不相溶的原理，油形成油膜將水包裹在其中，形成一個個微滴作為反應室。PCR反應結束后對每個微滴進行檢測，含有陽性樣品的微滴會有熒光信號(圖1)。微滴數字PCR以微滴為單位，PCR反應體系體積更小，因此更容易進行高通量實驗，而且系統簡單、成本低，是理想的數字PCR技術平臺。

圖1 微滴數字PCR原理Fig.1 Principle of droplet digital PCR

1.2.2微流控芯片數字PCR 微流控芯片數字PCR基于微流控芯片技術，能夠快速并準確地將樣品流體分成若干個獨立的單元，從而進行多步平行反應。這種數字PCR得益于微流體技術、納米制造技術和微電子技術等技術的發展，具有成本低、體積小和高通量的優勢，是理想的數字PCR平臺[9，11]。目前使用微流控芯片技術的數字PCR系統有Fluidigm公司的Bio-MarkTM基因分析系統、Life Technologies公司的QuantStudioTM3D數字PCR系統。

1.2.3微滴芯片式數字PCR 法國Stilla Technologies公司專注于開發新一代核酸絕對定量技術，其旗下品牌有NaicaTMCrystal全自動微滴芯片數字PCR。數字PCR過程的唯一耗材是cutting-edge微流體創新型芯片——Sapphire芯片。樣品通過毛細通道網格以25 000～30 000個微滴陣列形式進入2D芯片中，可稱作Crystal微滴，PCR擴增實驗在芯片上實現，采用微滴成像技術檢測含有擴增片段的微滴。最終對陽性微滴進行計數得到精準的核酸絕對數量[19]。

1.3 dPCR測量的影響因素

作為高精度參考方法，眾多影響因素都會對測量精度產生影響或造成測量結果的偏差，實驗過程中應控制或盡可能縮小這些影響因素對測量結果的影響。目標分子DNA濃度計算方法如式(1)所示。

(1)

式(1)中，P—陽性反應數，R—反應總數，VR—反應體積，D—稀釋因子。如等式(1)所示，反應總數和陽性反應數計數的多少會直接影響靶DNA拷貝數濃度，而制備PCR反應體系過程中樣品的稀釋產生的反應體積(VR)和稀釋因子(D)，其誤差也會反映到最終濃度上。除此之外，某些外部因素，如樣品制備、原液及任何中間稀釋溶液的均勻性和穩定性、DNA構象和熱溫度變化均會影響dPCR數據的質量。

一些研究[8，16]已闡述了反應數、陽性率和反應體積對dPCR濃度的影響。Corbisier等[20]研究闡述了微滴體積對拷貝數數據的影響，并表明拷貝數濃度依據液滴體積的變化而變化。因此，在使用dPCR進行計量時，最終結果需加上不確定度以確保目標分子拷貝數濃度結果的準確性。

1.4 測量的不確定度

為了得到更準確的實驗結果，實驗中需考慮測量值的偏差與不確定度[7]。任何測量都存在缺陷，由于所有的測量結果都會或多或少地偏離被測量的真值，所以在給出測量結果的同時指出所給測量結果的可靠程度是十分必要的。因此要用測量不確定度評定來指出測量結果的可靠程度[20]。

根據JJF1005-2016測量不確定度是根據所用到的信息，表征賦予被測量量值的分散性非負參數。根據測量不確定度的定義，標準不確定度以標準偏差表征。實際工作中則以實驗標準差S作為其估計值。

在標準物質研制的過程中，將定值不確定度與均勻性評估、穩定性考察引入的不確定度按照平方和開方的方法疊加就給出合成標準不確定度uCRM，該合成標準不確定度乘以包含因子k得出的不確定度稱為擴展不確定度U[21]。

2 數字PCR在核酸標準物質研制中的應用

近年來，我國生物制品產業逐步發展壯大，目前主要的生物制品有病毒性疫苗、細菌性疫苗、基因工程產品、血液制品、診斷試劑、基因芯片和基因治療產品等類型。同時，以核酸擴增為基礎的分子診斷技術正快速發展，并廣泛應用于醫學、出入境檢驗檢疫等領域。為了準確地定量核酸，需要用已知測量不確定性的量的靶核酸序列(拷貝數或拷貝數濃度)作為標準物質[5]。數字PCR作為一種絕對定量的方法，在多種領域的核酸標準物質研制中均有應用。

2.1 數字PCR在轉基因生物標準物質研制中的應用

截至2018年，全球共有70個國家種植或進口了轉基因作物，這已是全球連續應用轉基因作物的第23年。2018年，26個國家(21個發展中國家和5個發達國家)共種植了1.917億hm2轉基因作物，比2017年的種植面積增加了190萬hm2?，F如今，由于越來越多的轉基因作物得以在全球范圍內大規模種植和消費，多個國家和地區實施了轉基因產品標識管理制度。由于轉基因作物在種植收割、生產加工和運輸消費等過程中不可避免地出現混雜的情況，目前有60多個國家和地區對轉基因產品標識設置了閾值，如歐盟規定合法轉基因成分標識閾值為0.9%、非法轉基因成分標識閾值為0.5%，日本和俄羅斯規定的標識閾值為5%[22]。在這些國家和地區的規定中，產品中轉基因成分含量低于閾值可以不用標識。轉基因標識閾值是大勢所趨，我國相關部門也正將其引入轉基因安全管理體系當中。目前，AOCS已有GMO標物45種，歐盟IRMM及ERM 125種，中國研制GMO標準物質46種。轉基因生物標準物質根據其形態特征，可分為基體標準物質、基因組DNA標準物質和質粒DNA標準物質?；蚪MDNA和質粒DNA標準物質的形態是液體，基體標準物質的形態主要是粉末。

在基體標準物質中，通過使用雙重數字PCR法和熒光定量PCR方法結果互相比對驗證，研制了MON89788純品粉末標準物質。轉基因大豆MON89788是孟山都公司研發的耐除草劑品種，我國于2008年批準進口MON89788用作加工原料，是我國轉基因生物安全監管的重要對象。MON89788基體標準物質的研制彌補了前期研制的低濃度質量分數標準物質不能滿足定量檢測需求的缺陷。且數字PCR定值較熒光定量PCR技術更為準確，解決了國外純品標準物質無準確量值的問題[21]。

與此類似的還有使用二重數字PCR方法研制轉基因玉米MIR604的標準物質。實驗中使用了MIR604/Adh1進行二重數字PCR定量實驗，消除了單重數字PCR實驗中因取樣誤差造成的影響。轉基因玉米MIR604是先正達公司(Syngenta)研發的抗蟲轉基因玉米，我國2008年批準其進口用作加工原料，是我國進行轉基因生物安全監管的重要對象。研制轉基因玉米MIR604基體標準物質對轉基因玉米MIR604及其加工產品的定性和定量檢測，將為我國轉基因生物安全管理及標識制度的實施提供有效的技術支撐[23]。再如對于拜耳作物科學公司研發的轉基因玉米T25，有實驗室通過數字PCR的方法對樣品的特異性、動力學范圍等進行了檢測。最后通過多家實驗室的二重數字PCR法的聯合定值，研制了轉基因玉米T25的基體標準物質。T25已經在中國、美國、澳大利亞、加拿大、阿根廷、日本等國家被批準進口用作加工原料。T25標準物質的研制可用于對轉基因玉米T25及其加工產品的定性和定量檢測，有效加強了我國轉基因生物安全管理和標識制度[24]。除此之外，數字PCR技術還應用在水稻KeFeng6號質粒標準物質[25]、轉基因水稻品系“Bt汕優63”[21]、轉基因水稻KMD的標準物質研制中[26]。

2.2 數字PCR在臨床方面標準物質研制中的應用

隨著分子生物學技術的發展和普及，核酸的分析檢測技術已取得了重大進展?，F今臨床上通常采用PCR方法識別和定量DNA、RNA的變化，這是基因檢測的基本方法，但其具有一定的局限性。近年來，dPCR的發展使得高靈敏度和高精確度定量檢測稀有變異序列成為可能。dPCR在分析復雜的生物樣本上有很多的優勢，除了相較于qPCR具有高靈敏度的定量檢測能力外，還可以避免生物樣本中存在的多種抑制劑的干擾，由于數據的高度重復性，還可以提高各實驗室之間的檢測可比性。dPCR在醫療診斷標準物質中也有了相當廣泛的應用。

有研究通過數字PCR的方法研制了一種低濃度水平的短鏈DNA標準物質，用于低濃度水平循環腫瘤DNA(ctDNA)檢測過程的量值溯源，能夠對低濃度水平的短鏈基因標準物質的定值方法進行研究?；虍惓１磉_常誘發一些疾病的產生，ctDNA是一類具備廣泛應用前景的腫瘤標志物，可用于腫瘤早期的無創診斷、發展過程監測、預后判斷，以及個性化用藥指導，然而其含量非常低，約占整個循環DNA的1%，甚至只有0.1%，只有準確找到ctDNA并精準定量才能對疾病做出精準治療。ctDNA標準物質的研制給低濃度水平基因測試方法的發展提供了可靠的計量依據[27]。

2.3 其他應用

除用于轉基因檢測的生物標準物質和臨床上診斷所需的生物標準物質之外，還有許多其他應用領域。在已有和空缺的生物標準物質研發中，數字PCR技術作為比熒光定量PCR更精確先進的技術必然有著良好的應用前景。

在食品安全方面，世界各國都非常關注食品中微生物引起食源性疾病的預防與控制，其中關鍵技術環節便是食品中微生物的檢測技術。目前我國食品中微生物的檢測仍以傳統的病原菌培養、血清抗體檢測和生化特征比較等方法為主，不能滿足日益發展的檢驗檢疫工作需要。但與此同時，也有多家實驗室在使用數字PCR等新興方法研制新的生物標準物質。已有實驗室使用ddPCR制備了食品中腸侵襲性大腸埃希氏菌核酸標準樣品。從致病菌核酸標準樣品的關鍵制備技術和保存技術入手，開展均勻性和穩定性試驗，并對食品中致病菌核酸標準樣品的不確定度進行深入細致的分析計算，最終研制出具有較好均勻性和穩定性的腸侵襲性大腸埃希氏菌核酸標準樣品[28]。如Wen等[29]通過3種不同的方法對質粒濃度進行定量，其中包括數字PCR方法。最終開發了3個質粒候選RM。

在動物病毒方面，已有研究通過數字PCR法制備出了豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)國家二級標準物質。采用高精確度的數字PCR技術替代熒光定量PCR技術進行定值，從而充分保障了定值結果的可靠性和技術權威性[30]。

3 展望

核酸標準物質在醫療診斷、轉基因檢測、生物安全等方面有著極大的發展空間。PCR測量準確性對于疾病診斷和治療至關重要，并可應用于動植物疫病、轉基因植物等領域的檢測上。目前通用的金標準是qPCR，dPCR是qPCR的一種進化方法，具備精確性高、可靠性好，且不需依賴外參，已經用于多種化驗及測量領域。因其定量方法的精確性，已被用作核酸CRM定值的參考方法，在CRM的研制和檢測上都有很好地適用性和更加深遠的應用前景。當前新型冠狀病毒在全球肆虐新冠檢測方法在國家標準、地方標準等層面已提上標準化日程[31]。后疫情時代，為更加完善生物安全防護工作，需要擴大及加深生物安全領域標準物質的研發與應用，做到早識別、早防范。