HPLC法同時測定香丹注射液中9種成分

楊凌鑒 任莉莉 黃九林張勝海金華峰謝娟平賈 璞鄭曉暉*

（1.安康學院化學化工學院，陜西安康 725000；2.安康學院秦巴中藥資源研發中心，陜西安康 725000；3.安康學院醫學院，陜西安康 725000；4.西北大學生命科學學院，陜西西安 710069）

香丹注射液是將丹參水提物和降香飽和芳香水按照一定比例混合精制而成的現代中藥制劑,屬于國家部頒標準（WS3-B-3289-98）收載的藥物［1-3］?，F代研究［4-7］顯示,該制劑具有擴張血管、增強冠脈血流量等作用,能有效干預心肌缺血、腦缺血、機體缺氧,臨床上廣泛應用于冠心病、心絞痛、心肌梗死以及腦血管疾病的治療,療效顯著確切。

中藥療效的發揮是多成分、多靶點協同作用的結果,故開展多成分含有量測定有利于中藥材及其相關制劑的全面質量控制［8-9］。前期報道,香丹注射液中丹參所含的酚酸是與該制劑臨床療效密切相關的主要活性物質［10-11］,但目前其質量控制方法主要是選擇丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A中的幾種［2-3,12］或全部［10-11］進行定量分析,未涉及原兒茶酸、香草酸,而且檢測波長均設置為280 nm,可能會影響部分成分的檢測靈敏度。因此,本實驗在前期采用HPLC-Q-TOF/MS法對香丹注射液化學成分進行定性分析的基礎上［13］,建立HPLC法同時測定該制劑中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A的含有量,以期為其質量控制的完善提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀,配置G1312C二元泵、G1328B手動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315B二極管陣列檢測器、Chemstation 5.0化學工作站 （美國Agilent公司）；MS105DU型電子天平 （瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ULUP-I-10型超純水機（四川優普超純科技有限公司）；QL-901型快速混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 試劑與藥物 丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A對照品 （批號分別為DST180302-014、DST180428-081、DST180105-011、DST180311-088、DST181018-013、DST170524-028、DST180105-027、DST180128-009、DST180201-008）,均購于成都德思特生物技術有限公司,純度均大于98%。香丹注射液（批號1510201、1510202、1510203,國藥準字Z51021309,10 mL×5支）,購于四川升和藥業股份有限公司；色譜純甲醇 （德國Merck公司）；色譜純甲酸（美國Sigma Aldrich公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水（電阻率18.25 MΩ）,由優普ULUP-I-10超純水機系統制備。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流動相0.2% 甲酸水 （A）-甲醇（B）,梯度洗脫（0～25 min,7%～15% B；25～45 min,15%～25% B；45～80 min,25%～50%B；80～100 min,50%～80% B）；體積流量0.6 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm （0～46、58～100 min,丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A）、260 nm （46～52 min,香草酸）、320 nm （52～58 min,咖啡酸）；進樣量25 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A對照品適量,置于2.0 mL棕色量瓶中,丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛用50%甲醇定容,其余對照品用甲醇定容,制得質量濃度分別為8.00、3.20、2.40、2.60、2.00、3.00、2.80、5.20、2.20 mg/mL的貯備液,分別精密移取0.5 mL,甲醇稀釋,即得（444.00、178.00、133.00、144.00、111.00、167.00、156.00、289.00、122.00 μg/mL）,在4 ℃下冷藏備用。

2.2.2 供試品溶液 精密吸取注射液1.0 mL,置于5.0 mL棕色量瓶中,超純水定容至刻度,搖勻,經0.22 μm水系濾膜過濾,即得,在4 ℃下冷藏備用。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方比例和工藝流程,制備缺丹參的陰性樣品,按“2.2.2” 項下方法制備,即得,在4 ℃下冷藏備用。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液各25 μL,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,結果見圖1。由此可知,各成分色譜峰與相鄰峰均達到基線分離,理論塔板數按各成分計均大于5 000,陰性無干擾,表明該方法專屬性良好。

2.3.2 線性關系考察 將“2.2.1” 項下對照品溶液用甲醇依次稀釋至系列質量濃度,在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X）,峰面積為縱坐標（Y）進行回歸,分別以S/N=3、S/N=10為檢測限、定量限,結果見表1,可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6次,測得丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A峰面積RSD分別為0.79%、0.91%、1.60%、0.92%、1.18%、1.39%、0.98%、1.07%、1.40%,表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.4 重復性試驗 取同一批注射液 （批號1510203）,按“2.2.2” 項下方法平行制備6份供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,測得丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A含有量RSD分別為0.92%、2.30%、1.78%、1.98%、0.87%、1.06%、0.76%、0.51%、2.28%,表明該方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取同一批注射液（批號1510203）,按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液,分別于 0、2、4、8、12、24 h,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,測得丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A峰面積RSD分別為0.50%、1.99%、1.04%、0.99%、1.12%、1.82%、0.56%、0.60%、1.47%,表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密吸取各成分含有量已知的注射液（批號為1510203）0.5 mL,置于5 mL棕色量瓶中,按100% 水平加入對照品溶液0.5 mL （丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A質量濃度分別為1 510.20、6.15、385.61、3.92、8.09、176.38、325.95、696.46、52.54 μg/mL）,按“2.2.2” 項下方法平行制備6份供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,計算回收率。結果,丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A平均加樣回收率分別為100.83%、101.28%、103.14%、98.45%、97.79%、100.31%、99.54%、96.52%、102.69%,RSD分別為2.48%、2.27%、0.97%、1.32%、1.12%、1.79%、1.31%、1.04%、0.88%。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4 樣品含有量測定 取3批香丹注射液,按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液,每批平行3份,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,計算含有量,結果見表2。

表2 各成分含有量測定結果（μg/mL， n=3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （μg/mL， n=3）

3 討論

3.1 檢測指標篩選 研究表明,丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A具有抗心腦缺血、抑制血小板聚集、抗炎、保肝腎、抗氧化等多種顯著藥理活性［14-15］。因此,本實驗選擇上述9種酚酸類成分作為檢測指標。

3.2 色譜條件篩選 在前期研究中,已對流動相種類、洗脫方式、柱溫等參數進行了優化［13］,故本實驗僅需考慮水相添加劑和檢測波長即可。所檢測的成分均為酚酸類,常用的水相添加劑有甲酸、乙酸［16-17］,本實驗對其種類和加入量進行了考察,發現0.2%甲酸水洗脫時各成分峰形最好,色譜峰不拖尾。另外,丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A在280 nm波長處有最大紫外吸收［18］,而香草酸、咖啡酸分別在260 nm［19］、322 nm［20］波長處有最大紫外吸收,為了確保各成分均具有最佳的檢測靈敏度,本實驗采用分時間段變換波長模式進行分析。

4 結論

本實驗建立HPLC法同時測定香丹注射液中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A的含有量,該方法簡便準確,穩定可靠,可為該制劑質量控制的完善提供參考依據。