當歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42 誘導的SH-SY5Y細胞周期和凋亡的影響

賀春香，余婧萍，李富周，賀 旭，李 平，成紹武，宋禎彥

（湖南中醫藥大學，中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，湖南長沙 410208）

阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease,AD）是一種與衰老相關的進行性發展的神經系統退行性疾病,臨床上以認知功能障礙,特別是記憶障礙和視空間技能損害為主要特點。隨著人口老齡化日趨明顯,AD在老年人群的患病率逐年上升,我國65歲老人中患病率高達6.6%［1］。細胞外神經纖維斑塊和細胞內神經原纖維纏結是AD的主要病理特征,誘導這些致病轉化的分子機制尚不清楚［2］。腦內沉積的β-淀粉樣蛋白（amyloid-beta,Aβ）被認為是AD的關鍵病理過程［3］。Aβ 是由淀粉樣前體蛋白（Amyloid precursor protein,APP）經β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用而產生的含有39～43個氨基酸的多肽,其在腦內的沉積形成不溶性斑塊引發神經毒性作用是神經元凋亡的重要原因［4］。Aβ1-42處理的原代神經元在細胞周期標記物、DNA復制和有絲分裂突變方面存在異常表達［5］。研究表明,Aβ 刺激可以促進神經元的分化抑制蛋白1（inhibitor of differentiation-1,Id1）、音猬因子（sonic hedgehog,SHH）和Cyclin D1等細胞周期進程相關因子的異常表達,參與誘導終末分化的神經元細胞周期異常激活導致神經元脆裂、變性和死亡［6］。Aβ 也可引起神經元活性氧產生增多、DNA損傷［7］,使得防止神經元細胞周期再入的周期蛋白依賴性激酶5 （Cyclin Dependent Kinase 5,Cdk5）表達下降,在與Aβ 的共同刺激下,促使神經元細胞周期再入,一方面,作為細胞周期啟動蛋白Cyclin D1過表達激活成視網膜細胞瘤蛋白（Retinoblastoma protein,Rb）使其磷酸化,并向S期過渡；另一方面,過度損傷的DNA導致PARP（poly ADP-ribose polymerase）和p38 （Thr 180/Tyr 182）的激活,使得casepse3激活增多,Bax表達量升高以及Bcl-2/Bax比率的下降,從而導致神經元凋亡［8］。這種在進入細胞周期的合成階段之前,在G1至S點出現神經元細胞死亡,被經典地稱為“abortive cell cycle reentry”,其特征是細胞周期和凋亡蛋白的上調［9-10］。因此,研究干擾Aβ 依賴信號途徑的藥物對于預防AD腦內神經元細胞周期失調和凋亡引起的神經退行性病變具有一定的臨床意義。當歸芍藥散出自東漢張仲景的《金匱要略》,臨床觀察證明當歸芍藥散是治療AD的有效方劑［11-12］,實驗研究發現當歸芍藥散改善AD的認知功能主要與抗炎、抗氧化損傷、增強腦組織的能量代謝、促進突觸形成等相關［13-15］。本研究利用Aβ1-42誘導人神經母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）構建AD細胞模型來研究當歸芍藥散對Aβ1-42誘導的SH-SY5Y細胞周期和凋亡的影響。

1 材料

1.1 細胞 SH-SY5Y細胞株購自武漢普諾賽生物有限公司（貨號CL-0208）,用含10% 胎牛血清,100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素（美國Gibco公司,貨號分別為 10270-106,15070063）的DMEM/F12培養基 （美國Hyclone公司,貨號SH30023.01）在37 ℃、5% CO2的條件下培養。

1.2 動物 SD大鼠,10只,SPF級,雄性,體質量250～300 g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,實驗動物生產許可證號SCXK （湘）2013-0004,飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心。動物實驗方案通過湖南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會的批準（ZYFY20190905）。

1.3 藥物與試劑 當歸芍藥散由當歸7 g、白芍37.2 g、茯苓9.3 g、白術9.3 g、澤瀉18.6 g、川芎18.6 g組成,所有藥材均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科,由藥劑科主任戴冰教授鑒定為正品。Aβ1-42（美國Thermo Fisher Scientific公司,貨號03112）；噻唑藍（MTT）和乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司,貨號M8180、BC0685）；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（綠色熒光）（上海碧云天生物技術有限公司,貨號C1086）；細胞周期染色試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司,貨號CCS012）；Bax、Bcl-2、Cyclin D1、β-actin （北京博奧森公司,貨號分別為bs-0127M、bs-0032R、bs-0623R、bs-0061R）；山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗 （美國Sigma-Aldrich公司,貨號分別為AP132P、AP124）。

1.4 儀器 Z36HK超速冷凍離心機（德國Hermle公司）；Series 8000 WJ CO2培養箱（美國Thermo Fisher公司）；Axio Vert.A1倒置顯微鏡 （德國ZEISS公司）；Cytation3多功能酶標儀 （美國BioTek公司）；Gel Doc XR+凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；A1+共聚焦激光顯微鏡 （日本Nikon公司）；MoFlo XDP超速流式分選系統（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

2 方法

2.1 當歸芍藥散凍干粉制備 當歸芍藥散采用水提法制備凍干粉［13］。按處方比例稱取藥材100 g（當歸7 g、白芍37.2 g、茯苓9.3 g、白術9.3 g、澤瀉18.6 g、川芎18.6 g）,用5倍體積蒸餾水浸泡藥物2 h,100 ℃煮沸0.5 h,小火煨1 h,收集濾液。使用3倍體積蒸餾水按照上述步驟再次提取。2次提取物混合后,用旋轉蒸發器濃縮成浸膏。最后,將浸膏裝入凍干機真空冷凍干燥得到當歸芍藥散凍干粉。

2.2 含藥血清制備 取雄性SD大鼠10只隨機分為2組,給藥組大鼠灌胃給予當歸芍藥散濃縮液（生藥24 g/kg）,正常對照組給予同體積蒸餾水。灌胃7 d后,于末次灌胃后2 h后以3%水合氯醛（10 mL/kg）麻醉大鼠,暴露腹主動脈,用負壓采血管采集全血5 mL至無抗凝劑的普通采血管中,靜置過夜,3 000 r/min離心10 min,收集上清,經0.22 μm濾膜過濾,-80 ℃凍存備用。

2.3 Aβ1-42處理構建AD細胞模型 SH-SY5Y細胞生長處于對數期時,接種到培養板中培養24 h貼壁,根據課題組前期研究［16］,給予10 μmol/L Aβ1-42處理24 h構建AD細胞模型。。

2.4 分組及當歸芍藥散含藥血清干預 細胞分組為空白對照組（空白血清）,模型組（10 μmol/L Aβ1-42+空白血清）,當歸芍藥散含藥血清低、中、高干預組（10 μmol/L Aβ1-42造模后分別給予25、50、100 mL/L含藥血清干預24 h,即每升完全培養基中分別含有25、50、100 mL當歸芍藥散含藥血清,體積分數分別為2.5%、5%、10%）,采用“體積分數+受試藥物含藥血清” 的方式表達［13］。

2.5 細胞活率和LDH活性檢測 96孔板中按8×103/孔密度接種細胞培養貼壁,按方法10 μmol/L Aβ1-42處理24 h后,根據MTT試劑盒和LDH活性檢測試劑盒說明書方法檢測每個孔的細胞存活情況和LDH活性。

2.6 TUNEL染色檢測細胞凋亡 6孔板中放入蓋玻片接種4×105/孔細胞使細胞爬片,經試驗處理24 h后,用4%多聚甲醛室溫固定10 min,PBS清洗細胞,0.3% Triton-X透膜5 min,將TUNEL反應混合物加入細胞,37 ℃孵育1 h,DAPI染核5 min,PBS清洗后使用尼康A1+共聚焦顯微鏡10倍物鏡下掃描成像。隨機選取5個視野,采用Image J分析每組平均熒光強度,統計細胞凋亡率。

2.7 流式細胞術檢測細胞周期 6孔板接種4×105/孔細胞培養至貼壁,經試驗處理24 h后,按照細胞周期染色試劑盒所述方法操作。收集細胞離心棄上清,輕彈管壁,使沉淀重懸在殘余的液體中,加入1 mL室溫下的PBS。將細胞緩慢加入至3 mL無水乙醇（-20 ℃預冷）中,邊加邊高速攪拌。-20 ℃固定過夜。檢測當天,將固定細胞離心,棄去乙醇,輕彈管壁使沉淀松散,加入5 mL室溫下的PBS,放置15 min使細胞再次水化。離心,棄上清。加入1 mL PI染色液,室溫避光孵育30 min。選擇最低上樣速度,在貝克曼MoFlo XDP流式細胞儀上進行檢測,488 nm激發光源,使用FL2-RPE （578 nm）通道檢測。流式結果使用Modfit軟件進行分析。

2.8 Western blot檢測細胞周期和凋亡相關蛋白表達 細胞經實驗處理后使用RIPA法裂解細胞,30 Hz超聲10 s斷裂DNA,12 000 r/min離心15 min,取上清,BCA法檢測定量蛋白濃度,每孔上樣30 μg/孔,100 V電泳100 min,0.45 μm PVDF膜200 A濕轉90 min,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,封閉后一抗用TBST 1 ∶1000稀釋,β-actin為內參,4 ℃孵育過夜,二抗（1 ∶10 000）37 ℃避光孵育1 h,ECL化學發光法顯影,Gel Doc XR+凝膠成像系統成像計算灰度值統計分析。

2.9 統計學分析 采用SPSS 21.0進行數據的統計與分析,計量資料以（）表示,多組間比較采用單因素方差分析,先進行正態性分析和方差齊性檢驗,兩兩比較方差齊者用LSD檢驗,方差不齊者用Tamhane’s T2法檢驗,以P≤0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 當歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理的SHSY5Y細胞形態的影響 明場下觀察SH-SY5Y細胞生長情況（圖1）,空白對照組細胞生長良好,細胞細長呈梭形或者橢圓形,有樹枝狀軸突,細胞飽滿透亮。Aβ1-42處理24 h后SH-SY5Y細胞出現損傷,細胞密度有所下降,樹枝狀軸突消失,細胞部分皺縮,部分包膜出現破裂,細胞光澤變暗,細胞間隙增大。當歸芍藥散含藥血清干預后,細胞形態有所恢復,部分細胞恢復呈梭形或者橢圓形,細胞間隙變小。

圖1 不同濃度當歸芍藥散含藥血清干預Aβ1-42處理后SH-SY5Y細胞的形態學變化Fig.1 Morphological changes of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells due to Danggui Shaoyao Powder medicated serum treatment at different concentrations

3.2 當歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理的SHSY5Y細胞存活率和LDH活性的影響 MTT檢測結果（圖2）顯示,與空白對照組比較,模型組的SH-SY5Y細胞存活率下降（P＜0.01）。與模型組比較,給予當歸芍藥散含藥血清干預24 h后,5%、10%當歸芍藥散含藥血清組的SH-SY5Y細胞的細胞存活率均提高（P＜0.01）。LDH漏出率檢測結果（圖3）顯示,與空白對照組比較,模型組的SH-SY5Y細胞LDH漏出率升高（P＜0.01）；與模型組比較,當歸芍藥散含藥血清能一定程度降低模型組細胞LDH漏出率,5%、10%當歸芍藥散含藥血清組均具有統計學意義（P＜0.01）。

圖2 不同濃度當歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理后SHSY5Y細胞存活率的影響（n=6）Fig.2 Effects of Danggui Shaoyao Powder medicated serum at different concentrations on the cell viability of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells （n=6）

圖3 不同濃度當歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理后SHSY5Y細胞LDH活性的影響（n=6）Fig.3 Effects of Danggui Shaoyao Powder medicated serum at different concentrations on the LDH activity of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells （n=6）

3.3 當歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理的SHSY5Y細胞凋亡的影響 細胞凋亡結果顯示（圖4）當歸芍藥散含藥血清呈濃度依賴性抑制Aβ1-42介導的SH-SY5Y細胞凋亡。熒光強度統計分析結果顯示（表1）,與空白對照比較,10 μmol/L Aβ1-42處理SH-SY5Y細胞24 h后,細胞凋亡率增高（P＜0.05）,細胞凋亡率為（48.12±5.28）%。與模型組比較,5%、10%當歸芍藥散含藥血清干預24 h后細胞凋亡率為 （17.69 ± 4.26）%、（15.64 ±4.15）%,P＜0.01表示差異有統計學意義。

表1 不同濃度當歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42 處理后SHSY5Y細胞凋亡的影響（， n=3）Tab.1 Effects of Danggui Shaoyao Powder medicated serum at different concentrations on the apoptosis rate of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells（， n=3）

表1 不同濃度當歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42 處理后SHSY5Y細胞凋亡的影響（， n=3）Tab.1 Effects of Danggui Shaoyao Powder medicated serum at different concentrations on the apoptosis rate of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells（， n=3）

注：與空白對照組比較,##P＜0.01；與模型組比較,**P＜0.01。

圖4 TUNEL染色檢測不同濃度當歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理后SH-SY5Y細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of Danggui Shaoyao Powder medicated serum at different concentrations on the apoptosis of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells using TUNEL

3.4 當歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理的SHSY5Y細胞周期的影響 流式細胞術檢測細胞周期結果顯示（表2、圖5）,與空白對照組比較,模型組SH-SY5Y細胞在10 μmol/L Aβ1-42處理24 h后,G0/G1期細胞數量無變化,S期細胞數量增加（P＜0.05）,G2/M期細胞數量下降（P＜0.05）。與模型組比較,2.5%當歸芍藥散含藥血清組細胞周期G0/G1、S、G2/M期均差異無統計學意義；5%、10% 當歸芍藥散含藥血清干預后G0/G1期細胞數量無變化,S期細胞數量減少（P＜0.05）,G2/M期細胞數增加（P＜0.05）。提示Aβ1-42處理后SHSY5Y細胞大量進入細胞周期,停滯于S期,細胞周期阻滯；5%、10% 當歸芍藥散含藥血清干預后能改善Aβ1-42對SH-SY5Y細胞周期的影響。

3.5 當歸芍藥散含藥血清干預后周期蛋白Cyclin D1和凋亡相關蛋白的表達 Western blot結果顯示（圖6、表3）,與空白對照組比較,Aβ1-42處理后周期相關蛋白Cyclin D1表達上調（P＜0.01）,抑制凋亡蛋白Bcl-2表達下降,促凋亡蛋白Bax表達升高（P＜0.01）；與模型組比較,5%、10% 當歸芍藥散含藥血清干預后Cyclin D1蛋白表達降低（P＜0.05）,Bcl-2蛋白表達升高（P＜0.01）,Bax蛋白表達下降（P＜0.01）。

表2 不同濃度當歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理后SH-SY5Y細胞周期的影響（， n=5）Tab.2 Effects of Danggui Shaoyao Powder medicated serum at different concentrations on the cell cycle of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells （， n=5）

表2 不同濃度當歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理后SH-SY5Y細胞周期的影響（， n=5）Tab.2 Effects of Danggui Shaoyao Powder medicated serum at different concentrations on the cell cycle of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells （， n=5）

注：與空白對照組比較,##P＜0.01；與模型組比較,**P＜0.01。

圖5 不同濃度當歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理后SH-SY5Y細胞周期的影響Fig.5 Effect of Danggui Shaoyao Powder medicated serum at different concentrations on the cell cycle of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells

4 討論

圖6 Western blot檢測各組蛋白表達Fig.6 Detection of the protein expression of each group by Western blot

表3 當歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理后SH-SY5Y細胞Cyclin D1和凋亡相關蛋白的影響（， n=3）Tab.3 Effects of Danggui Shaoyao Powder medicated serum on the apoptosis related proteins and Cyclin D1 of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells （， n=3）

表3 當歸芍藥散含藥血清對Aβ1-42處理后SH-SY5Y細胞Cyclin D1和凋亡相關蛋白的影響（， n=3）Tab.3 Effects of Danggui Shaoyao Powder medicated serum on the apoptosis related proteins and Cyclin D1 of Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells （， n=3）

注：與空白對照組比較,##P＜0.01；與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

中醫學認為癡呆病位在腦,與肝、腎、脾三臟密切相關,肝失疏泄,脾失健運,腎乏氣化,分清泌濁失司,釀生痰濁血瘀,痰瘀互結,蒙蔽神明［17］。中醫認為治療老年癡呆當以養肝補腎為主,當歸芍藥散方中重用白芍養血調肝,當歸充補肝血以補腎精；川芎活血通絡,引血上行；白術、茯苓、澤瀉健脾利濕,有化痰排濁功效,利于腎濁排出,諸藥合用具有滋補肝腎,活血化瘀,化痰通絡。上世紀80年代,日本學者首先發現當歸芍藥散能改善AD患者的運動障礙和認知功能下降［18］,隨后國內外許多當歸芍藥散抗衰老的臨床報道和實驗室研究資料表明［19-20］,當歸芍藥散具有抗衰老作用,主要表現為提高學習記憶能力,清除自由基、抗氧化,增強海馬神經突觸可塑性等［15］,本研究結果表明,當歸芍藥散能抑制Aβ 引起細胞周期失調和細胞凋亡,具有神經保護作用。

本研究重點考察當歸芍藥散通過對Aβ 所導致的神經元細胞周期再入和細胞凋亡的調控作用,探索中藥復方當歸芍藥散防治神經退行性疾病的作用機制,故采用Aβ1-42處理SH-SY5Y細胞構建AD細胞模型。G1/S-特異性周期蛋白-D1 （Cyclin D1）,與細胞周期激活和G1/S期進展相關。當細胞進入S期后,可CyclinD1過表達可使細胞縮小,縮短G1期,加速進入S期。Aβ 使CyclinD1水平的增加并使細胞脫離有絲分裂后期,重新進入細胞周期［21］。而正常的成年神經元細胞不再進入細胞周期（而是停留在G0期）,屬于永久性的有絲分裂后細胞,神經元細胞周期的異常激活會導致細胞的死亡［22］。在AD患者大腦中,CyclinD1的積累與細胞周期激活相關,并最終導致細胞的死亡［23］。同樣有研究發現用Aβ 作用于SH-SY5Y后,細胞周期進展不會超過S期,并伴隨著細胞的凋亡［24］。此外,CyclinD1的核定位功能使神經元能保持為終末分化狀態,同時它的核入口調節功能在神經元細胞周期退出中起到重要作用［25］。通過流式細胞術檢測細胞周期結果顯示,Aβ1-42處理后,SH-SY5Y細胞S期細胞數量顯著增加,G2/M期顯著減少,表明Aβ 能促進SH-SY5Y細胞進入細胞周期,但大量停留在S期而沒有進入G2/M期,表現為細胞周期阻滯,并可能進一步誘發細胞凋亡［26］。當歸芍藥散含藥血清干預后與模型組比較,S期細胞數量顯著減少,G2/M期細胞數量顯著增加,提示當歸芍藥散含藥血清干預后能改善Aβ1-42誘導的SHSY5Y細胞周期再進入。課題組推測,可能的機制是由神經元中Aβ 的刺激,迫使神經元進入細胞周期,然而,細胞周期功能失調阻礙了神經元的成功分裂,或者使它們變得脆弱,導致神經元變性,最終死亡,而當歸芍藥散能有效的減輕Aβ 引起的SH-SY5Y細胞周期再進入和神經元凋亡。

抗凋亡蛋白Bcl-2是線粒體凋亡的中心調控因子并阻止Bax和Bak的同質寡聚化,在AD患者大腦中會出現下調［27］。Bax是Bcl-2家族的促凋亡蛋白,Bax的過度表達可拮抗Bcl-2的保護效應而使細胞趨于死亡。研究表明Bax易位 （激活）參與Aβ 誘導的細胞凋亡過程［28-29］。Bax/Bcl-2 2種蛋白之間的比率是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素。研究發現,Aβ 會通過改變線粒體核裂變和核聚變蛋白質促進氧化應激介導的線粒體動力學損傷最終導致SH-SY5Y細胞凋亡,并伴隨著Bax/Bcl-2比率的升高［30］。同時體內實驗發現Aβ 誘導的神經毒性的大鼠海馬區的BaxmRNA水平出現上升［31］。通過Western blot對蛋白Bax和Bcl-2進行檢測,結果顯示Aβ1-42處理后促凋亡蛋白Bax表達顯著升高,Bax激活增多,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達,使其表達顯著下降,與模型組比較,當歸芍藥散含藥血清干預后Bax蛋白表達出現不同程度下降,對Bcl-2蛋白的抑制作用降低,Bcl-2蛋白的表達出現不同程度升高。說明Aβ 通過對Bax/Bcl-2的調節誘導SH-SY5Y細胞凋亡的發生,當歸芍藥散對Aβ 誘導的細胞凋亡具有保護作用。

本研究采用Aβ1-42處理SH-SY5Y細胞構建AD細胞模型,給予不同濃度當歸芍藥散含藥血清干預。結果提示當歸芍藥散能明顯減輕Aβ1-42引起的SH-SY5Y細胞損傷,抑制細胞周期再進入和細胞凋亡,發揮神經保護作用。