大蒜素對白色念珠菌毒力因子作用機制的研究

熊延靖，吳艷紅，陳 京

（皖南醫學院，醫學微生物學與醫學免疫學教研室，安徽蕪湖 241002）

白色念珠菌Candida albicans是常駐于人體內的一種條件致病性真菌。目前隨著抗癌藥物、HIV感染、免疫抑制劑的大量使用等引起的免疫功能下降,以及侵入性治療如血透、插管技術等廣泛應用,均可能造成全身或局部真菌感染。據相關統計,侵襲性念珠菌病在全球范圍內已達25萬人/年,死亡案例超過5萬［1］,并且已成為重癥監護室重癥感染的首要病因［2］。由于抗真菌藥物本身的不良反應,同時藥物的不合理應用導致的耐藥問題亦日趨嚴重［3］,給抗感染治療帶來巨大挑戰。因此,尋找新型高效、廣譜、低毒的抗真菌藥物具有重要意義。

大蒜素是從百合科植物大蒜Allium sativumL.的鱗莖中提取的含硫有機化合物的主要有效成分［4］。研究顯示大蒜素對多種細菌、真菌、病毒和寄生蟲等均具有良好的抑制作用,被譽為天然廣譜抗生素藥物［5］。本研究旨在探討大蒜素對白色念珠菌毒力因子的作用機制,以期闡明大蒜素的抗真菌作用機制,為豐富大蒜素的臨床應用奠定科學基礎；同時拓寬大蒜素的應用價值,加快傳統中醫藥的發展。

1 材料

1.1 供試菌株 白色念珠菌標準菌株：AX2-2086,購自廣州市微生物研究所。臨床分離念珠菌4株,CA1、CA2、CA3、CA4。經科瑪嘉念珠菌顯色培養基和酵母樣真菌鑒定卡鑒定為白色念珠菌。所有菌株均連續在改良沙氏固體培養基中接種2次,保持菌株活力,4 ℃保存備用。

1.2 試劑與藥物 二甲基亞砜 （DMSO,美國Sigma公司,批號D2650）；RPMI-1640培養基（批號 BL303A）、PBS磷酸鹽緩沖液 （批號BL302A）（北京Biosharp公司）；葡萄糖 （批號F20190509）、甘露醇（批號20190321）（國藥集團化學試劑有限公司）；蛋白胨（北京Solarbio公司,批號P8450）；營養肉湯（北京Solarbio公司,批號N8300）；瓊脂粉（北京奧博星生物技術有限責任公司,批號01-023）；卵黃乳液（青島海博生物技術有限公司,批號HB8295）；科瑪嘉念珠菌顯色培養基（批號CA220）、酵母樣真菌鑒定卡（批號21343）（法國-生物梅里埃公司）。RNA提取試劑盒（美國Omega公司,批號R6870-01）；逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司,批號RR047A）；qRTPCR試劑盒 （瑞士 Roche公司,批號6402712001）；引物（上海生工生物工程有限公司合成）。大蒜素（江蘇正大清江制藥有限公司,國藥準字H32025683,批號190307）。

1.3 儀器 BECKMAN Allegra 64R高速冷凍離心機（美國貝克曼公司）；THERMOFISHER IMH100隔水式電熱恒溫培養箱（美國Thermofisher公司）；微量培養板 （96孔、6孔；美國Coring公司）；ESCO CLASSⅡBSC生物安全柜（新加坡艾斯克公司）；ZQZY-VS2恒溫振蕩培養箱（上海知楚儀器有限公司）；ELGA Purelabflex 2純水機（英國埃爾格公司）；FA2004型電子分析天平（上海良平儀器儀表有限公司）；雙目顯微鏡、倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；BioDrop核酸蛋白分析儀（英國柏點公司）；Biotek Eon全波長酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；Roche lighelycler 96熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）。

1.4 培養基制備

1.4.1 改良沙氏培養基 葡萄糖40 g、蛋白胨10 g,加入雙蒸水定容至1 L,112 ℃高壓滅菌15 min,待培養基冷卻至50 ℃左右時加入青霉素20 U/mL、鏈霉素40 U/mL,即為改良沙氏液體培養基。若制備改良沙氏固體培養基,則在上述改良沙氏液體培養基中加入瓊脂20 g再高壓滅菌。4 ℃保存備用。

1.4.2 Spider培養基 營養肉湯10 g、甘露醇10 g、K2HPO42 g,加入雙蒸水定容至1 L,調整培養基pH 7.2 （25 ℃）,121 ℃高壓滅菌20 min,4 ℃保存備用。

1.4.3 卵黃乳液瓊脂培養基 NaCl 5.73 g、蛋白胨1 g、葡萄糖3 g、CaCl20.055 g、瓊脂粉2 g,加入雙蒸水定容至100 mL。121 ℃高壓滅菌20 min,待高壓鍋溫度降至70 ℃時,立即取出并加入10%卵黃乳液混勻。在培養基中分別加入不同濃度大蒜素（終濃度為1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC）,混勻后分裝至無菌培養皿,4 ℃保存備用。

2 方法

2.1 菌液制備 將白色念珠菌標準菌株和臨床菌株分別接種于改良沙氏固體培養基中,37 ℃培養48 h后,挑取培養基中單克隆菌落,轉種至5 mL改良沙氏液體培養基,于37 ℃、200 r/min振蕩培養16 h,使白色念珠菌處于對數生長期。經麥氏比濁管及血細胞計數板計數,以RPMI-1640培養液將菌液調整至濃度為2×106CFU/mL,4 ℃保存備用。

2.2 藥液制備 將大蒜素溶解于DMSO中,再用RPMI-1640培養液作倍比稀釋,使其質量濃度依次為800、400、200、100、50、25、12.5、6.25 μg/mL。4 ℃保存備用。

2.3 大蒜素對白色念珠菌的最低抑菌濃度（MIC）測定 按照美國臨床和實驗室標準化研究所（CLSI）推薦的真菌敏感性檢測方法CLSI-M27-A3［6］,采用微量液基稀釋法中的操作步驟進行并略作改良。

用RPMI-1640培養液將白色念珠菌菌液濃度稀釋至2×103CFU/mL。將上述濃度的大蒜素依次加入96孔微量培養板中,每孔100 μL,并設生長對照孔（RPMI-1640培養液100 μL+菌液100 μL,無大蒜素）和空白對照孔 （RPMI-1640培養液200 μL,無菌液,無大蒜素）,每個濃度均設3復孔。將配制好的菌液加入相應孔中,每孔100 μL,使得每一梯度藥液和菌液分別被1 ∶1稀釋至終濃度。將96孔微量培養板置37 ℃溫箱靜置培養48 h后觀察結果。以上實驗在不同時間重復3次。

結果判斷采用視覺法,肉眼觀察孔內菌株生長情況,與不含藥物的空白對照孔比較,觀察到生長完全抑制、培養基清亮所對應的最低藥物濃度為MIC。

2.4 白色念珠菌時間-殺菌曲線 采用不同時間點取樣點板計數的方法繪制大蒜素對白色念珠菌的時間-殺菌曲線。選取白色念珠菌標準菌株AX2-2086和臨床菌株CA2為試驗菌株（下同）。具體實驗操作步驟為：取對數生長期的白色念珠菌,用沙氏改良液體培養基稀釋菌液濃度為2×106CFU/mL。以各試驗菌株的MIC值為依據,設置大蒜素終濃度依次為 1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC。將白色念珠菌菌液2 mL加入無菌試管中,再依次加入不同濃度大蒜素。同時設立不加藥物的空白對照組?；靹蚝笾?7 ℃,200 r/min恒溫振蕩培養。分別于培養0、2、4、8、12、24 h時取10 μL菌液按10倍倍比稀釋,取100 μL稀釋液均勻涂布于改良沙氏固體培養基上。37 ℃培養48 h后計算菌落數目。以時間點為橫軸,以不同時間點生長的菌落數的對數為縱軸,繪制時間-殺菌曲線。

2.5 大蒜素對白色念珠菌形態轉化的影響 檢測大蒜素對白色念珠菌標準菌株AX2-2086和臨床菌株CA2在Spider液體培養基中形態轉化能力的影響。用Spider液體培養基將白色念珠菌稀釋至2×106CFU/mL。將菌液和不同濃度大蒜素分別加入6孔板中,大蒜素終濃度分別為1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC。同時設立不加藥物的空白對照孔。37 ℃靜置孵育6 h。取出孔板,在倒置顯微鏡明場下觀察白色念珠菌菌絲形成情況并拍照。

2.6 qRT-PCR檢測大蒜素對菌絲相關基因表達的影響

2.6.1 總RNA提取 將大蒜素與菌液混勻,置37 ℃靜置培養24 h后,收集菌體,用無菌PBS緩沖液清洗3次后提取總RNA,按照試劑盒說明書進行。

2.6.2 引物設計與合成 所用引物序列見表1,由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR

2.6.3 cDNA制備 根據TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書操作。第一步,RNA 1 μg,5×gDNA Eraser Buffer 2 μL,gDNA Eraser 1 μL,加RNase Free dH2O至10 μL,反應條件為42 ℃2 min；第二步,取第一步反應液10 μL,Master Mix 10 μL,反應條件為37 ℃15 min,85 ℃5 sec。

2.6.4 實時熒光定量PCR反應 按照試劑盒說明,制備反應體系見表2。將所有試劑加好后,置于熒光定量PCR儀中進行反應,反應條件為預變性95 ℃600 s；擴增定量程序為95 ℃10 s,60 ℃15 s,72 ℃20 s,擴增程序為45個循環；熔解曲線65～95 ℃。每個樣品平行3次。

表2 RT-PCR反應體系Tab.2 Reaction system of RT-PCR

2.6.5 定量分析 qRT-PCR分別測定的目的基因和內參基因的CT值,將實驗結果取平均值,計算并統計。最后基因表達水平用2-△△CT法進行分析。

2.7 大蒜素對白色念珠菌細胞外磷脂酶活性的影響 分別取白色念珠菌標準菌株AX2-2086和臨床菌株CA2的菌液（1×107CFU/mL）1 μL,滴加在含有不同濃度大蒜素（終濃度為1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC）的卵黃乳液瓊脂培養基中,同時設置不加藥物的空白對照組。將培養基置37 ℃培養4 d后,白色念珠菌在平板上形成菌落,并在菌落周圍形成乳黃色不透明的沉淀圈。實驗重復3次。用游標卡尺測定菌落直徑和沉淀圈（含菌落）直徑。細胞外磷脂酶活性用Pz表示,Pz=d1/d2,其中,d1為菌落直徑,d2為沉淀圈直徑。 Pz值越小,表明磷脂酶活性越強,反之則活性越弱。

2.8 統計學分析 所有數據應用SPSS 21.0統計軟件進行分析處理,計量資料以（）表示,組間差異比較采用單因素方差分析檢驗,P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大蒜素對白色念珠菌的MIC值 采用CLSIM27-A3推薦的微量稀釋法,經過3次重復體外藥物敏感性試驗,大蒜素對白色念珠菌標準菌株AX2-2086的MIC為25 μg/mL。對于臨床分離菌株,大蒜素的MIC為12.5～25 μg/mL。結果見表3,表明,大蒜素對白色念珠菌具有良好的抑菌作用。后續選用白色念珠菌標準菌株AX2-2086和臨床菌株CA2作為試驗菌株。

表3 大蒜素對白色念珠菌的MIC值（μg/mL）Tab.3 MIC values of allicin to C.albicans（μg/mL）

3.2 大蒜素對白色念珠菌的時間-殺菌曲線 時間-殺菌曲線可以反映各時間點藥物的抑菌或殺菌作用。本實驗通過計數平板上白色念珠菌單克隆菌落的數量,并根據稀釋倍數計算出原始CFU。結果表明,2 MIC和4 MIC濃度的大蒜素對白色念珠菌保持有效的抑制作用,1 MIC濃度組也具有一定的抑制作用。但是1/4 MIC濃度組未顯示明顯抑制作用,這與大蒜素對白色念珠菌的MIC值結果基本相符,見圖1。

圖1 大蒜素對白色念珠菌的時間-殺菌曲線Fig.1 Time-kill curve of allicin against C.albicns

3.3 大蒜素抑制白色念珠菌的形態轉化 菌絲是白色念珠菌最主要的致病因子之一,酵母相-菌絲相形態轉化也是其生物被膜形成的重要一步［7］。通過倒置顯微鏡觀察大蒜素對白色念珠菌菌絲形成的影響,結果見圖2。在Spider液體培養基中,未經藥物處理的白色念珠菌能在6 h內形成較長且密的菌絲,錯綜復雜,相互纏繞重疊。當加入1 MIC濃度大蒜素時,視野內可觀察到菌絲長度明顯變短,且與對照組比較數量明顯減少。而4 MIC濃度則能夠基本抑制菌絲的生長,鏡下觀察以酵母相細胞為主。這一現象表明,大蒜素可以抑制白色念珠菌由酵母相向菌絲相的轉化,且這種抑制作用具有劑量依賴性,即隨著藥物濃度的升高,抑制作用更加明顯。

3.4 大蒜素對白色念珠菌菌絲相關基因表達的影響 與空白對照組比較,經1 MIC、2 MIC和4 MIC濃度的大蒜素干預后,參與正向調控白色念珠菌菌絲生長的基因RAS1、 CDC35、 EFG1的表達均明顯下降,而負向調控菌絲生長的基因PDE2的表達量增加,差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3,結果顯示,大蒜素對白色念珠菌菌絲生長的作用機制可能是通過調節菌絲形成相關基因的表達,從而抑制菌絲的形成。

圖2 大蒜素對白色念珠菌形態轉化的影響（×400）Fig.2 Effect of allicin on morphological transition of C.albicans（×400）

圖3 大蒜素對白色念珠菌菌絲相關基因表達的影響Fig.3 Effect of allicin on gene expression of C.albicanshyphae

3.5 大蒜素抑制白色念珠菌細胞外磷脂酶活性卵黃乳液瓊脂平板法是檢測細胞外磷脂酶的經典方法［8］。在結果觀察中,菌落直徑代表菌細胞數目的多少,沉淀圈直徑代表磷脂酶催化的沉淀產物的量,兩者直徑比值（Pz）可近似反映單位細胞數量的磷脂酶活性。 Pz越低,反映磷脂酶產生越多,活性越強。圖4表明,白色念珠菌標準菌株AX2-2086和臨床菌株CA2均能分泌較高活性的磷脂酶。加入濃度為1/4 MIC大蒜素未能明顯改變磷脂酶活性,菌體仍能分泌活性較高的磷脂酶。當大蒜素濃度≥1/2 MIC時,與空白對照組比較,白色念珠菌細胞外磷脂酶的活性降低,Pz逐漸升高。結果表明,大蒜素可以抑制白色念珠菌細胞外磷脂酶的活性。

4 討論

目前,應用于臨床的抗真菌藥物數量和種類有限,但是由于臨床上有限抗真菌藥物的大量使用,導致真菌耐藥性的情況日益嚴重,而且出現交叉耐藥現象［9］。其中白色念珠菌是臨床最常見的條件致病性真菌。白色念珠菌在體內最主要的致病原因在于宿主免疫功能受損導致的不受控制的增殖。過度的增殖導致白色念珠菌毒力因子的釋放,進而對機體造成危害［10］。白色念珠菌的毒力因子主要包括粘附、分泌酶、形態轉化、生物被膜的形成等等。

圖4 大蒜素對白色念珠菌細胞外磷脂酶活性的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of allicin on the activity of phospholipase of C.albicans

在白色念珠菌的毒力因子中,形態轉化是最主要也是最吸引注意力的一種。白色念珠菌是一種二相性真菌,從形態上分為酵母相和菌絲相。在相關誘導因素的刺激下,白色念珠菌能經歷酵母相和菌絲相的相互轉化。在被感染宿主體內的病灶部位,2種形態的白色念珠菌都能被發現。相關研究發現,在小鼠系統性感染中,多種菌絲形成缺陷的白色念珠菌突變體,其毒力是減弱的［11］。因此,如果能抑制白色念珠菌形態的轉化,或許能抑制其毒力和感染性。

Spider培養基常被用來評估白色念珠菌維持菌絲生長的能力［12］。在本實驗中,將白色念珠菌標準菌株AX2-2086和臨床菌株CA2接種到Spider液體培養基中,鏡下觀察發現白色念珠菌形成細長的錯綜復雜的菌絲。加入大蒜素后可抑制菌絲的形成,甚至基本抑制白色念珠菌的形態轉化,使其停留在酵母相。

Ras-cAMP-Efg1途徑是調節白色念珠菌由酵母相到菌絲相轉化的重要信號通路之一,其中第二信使cAMP是重要的調控分子。cAMP由Cdc35酶合成,Pde2酶降解［13］?；駿FG1編碼的菌絲生長蛋白是目前研究最深入的多功能調節因子之一,它可以正向調節菌絲的形成過程,并在生物膜形成過程中起著中心作用［14］。為驗證大蒜素對白色念珠菌菌絲形成的作用機制,實驗進一步通過qRTPCR檢測了菌絲相關基因的表達。結果顯示,與空白對照組相比,大蒜素能夠下調與菌絲形成正相關基因（RAS1、 CDC35、 EFG1）,并上調菌絲形成負相關基因（PDE2）的表達。

細胞外磷脂酶是白色念珠菌重要的毒力因子之一,磷脂酶的高表達與小鼠播散性念珠菌病具有顯著相關性,而磷脂酶缺陷的白色念珠菌突變體在小鼠系統性感染模型中的毒力是減弱的［15-16］。本實驗通過卵黃乳液瓊脂培養基測定大蒜素對白色念珠菌細胞外磷脂酶活性的作用,發現加入大蒜素后,白色念珠菌分泌磷脂酶活性降低,表明大蒜素能夠有效地抑制白色念珠菌細胞外磷脂酶活性,從而發揮抗真菌作用。

綜上所述,大蒜素可通過抑制白色念珠菌菌絲生長、調節菌絲相關基因的表達,以及抑制細胞外磷脂酶活性等,從而發揮抑制白色念珠菌毒力因子的作用。這將為拓寬大蒜素潛在的臨床用途奠定了基礎。但大蒜素對體內白色念珠菌毒力因子的干預效應尚有待于進一步揭示。