HPLC法評估補腎強身膠囊中酒女貞子的質量

張鵬程，張崇生，倪 贊

（溫州市食品藥品檢驗科學研究院，浙江溫州 325008）

補腎強身膠囊由淫羊藿、金櫻子、菟絲子、酒女貞子和燙狗脊5味藥材組方而成,主治腰酸足軟、頭暈耳鳴、眼花心悸、陽痿遺精等癥狀［1］。酒女貞子為方中臣藥,其制法為取凈女貞子,照酒燉法或酒蒸法（通則0213）燉至酒吸盡或蒸透［2］。女貞子酒制后涼滑之性緩和,滋補肝腎作用增強［3-4］。較多文獻研究表明女貞子炮制后環烯醚萜苷類成分如特女貞苷含有量降低,紅景天苷含有量升高［5-8］。

補腎強身膠囊現行標準有衛生部藥品標準中藥成方制劑第四冊標準和多個企業注冊標準,這些標準過于簡單,無法有效控制內在質量。2015年版《中國藥典》 標準除性狀外無法有效區分生品女貞子和炮制品,制成中成藥后更無法評估藥材質量。紀鑫等［8］研究發現合格酒女貞子中特女貞苷與紅景天苷比值（比值）不大于8；趙淑淑等［9］通過建立薄層色譜和特女貞苷含有量測定方法完善和提高酒女貞子配方顆粒的質量標準；范妙璇等［10］通過HPLC測定二至丸中的特女貞苷、紅景天苷和酪醇的含有量,綜合評價其質量。然而這些研究均未涉及中成藥中酒女貞子炮制相關的指標。

因此,本實驗建立HPLC法測定補腎強身膠囊中紅景天苷和特女貞苷的含有量,通過兩者含有量比值分析酒女貞子的炮制程度,以此評估10個生產企業29批樣品中酒女貞子的質量。

1 材料

1.1 儀器 Shimadzu LC-20AD高效液相色譜（日本島津公司）；XS205DU分析天平（十萬分之一,瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；SB-5200D超聲波清洗器（寧波生物科技股份有限公司）；TGL-16C高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；Milli-Q Integal 5超純水器 （德國Millipore公司）；美的WH2237電磁爐（美的集團股份有限公司）；不銹鋼多層蒸鍋（君匯商用廚具直銷店）。

1.2 試劑與藥物 對照品紅景天苷 （批號110818-201708）、特女貞苷（批號111926-201605）均購于中國食品藥品檢定研究院。原藥材購于浙江華宇藥業股份有限公司,經溫州市食品藥品檢驗科學研究院謝秉湘副主任中藥師鑒定均為對應藥材正品。29批補腎強身膠囊均來自2019年浙江省藥品質量考核抽檢樣品。乙醇為分析純；乙腈為色譜純；黃酒酒精度為14.5%。

2 方法與結果

2.1 補腎強身膠囊與酒女貞子制備 按衛生部藥品標準中藥成方制劑第四冊處方比例制備9批補腎強身膠囊樣品,按處方比例除去酒女貞子制備1批酒女貞子陰性樣品。參照2015年版《中國藥典》女貞子項下酒女貞子制備中的酒蒸法和文獻［8］制備酒女貞子。分別取3批女貞子飲片各400 g,加入100 g黃酒悶潤15 h,分裝至平皿中,每份50 g,放入蒸鍋,電磁爐上蒸制,待蒸鍋中蒸氣飽滿后開始計時,分別于蒸制3、6、9、12、15、18、21、24 h時各取一份樣品,晾干24 h后,60 ℃干燥5 h,作為實驗室自制的不同炮制時間的酒女貞子樣品。

2.2 混合對照品溶液制備 取紅景天苷對照品約12.5 mg,精密稱定,加甲醇定容至25 mL,作為紅景天苷對照品貯備液。取特女貞苷對照品約12.5 mg,精密稱定,精密加入紅景天苷對照品貯備液5 mL,甲醇定容至25 mL,混勻,即得。

2.3 供試品溶液制備 取補腎強身膠囊10粒,傾出內容物,研細混勻,稱取約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%乙醇50 mL,稱定質量,超聲（250 W,40 kHz）處理30 min,放冷至室溫,用50% 乙醇補足減失的質量,搖勻,離心取上清,經0.45 μm微孔濾膜過濾,取續濾液,即得。取酒女貞子粉末 （過5號篩）,稱取約0.25 g,精密稱定,按“2.2” 項下方法制備。

2.4 色譜條件 采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm,5 μm）,流動相乙腈（A）-水（B）,梯度洗脫（0～10 min,5%A～15%A；10～30 min,15%A～25%A；30～35 min,25%A～50%A；35～45 min,50%A～5%A）；體積流量1.0 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長224 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,制成不同質量濃度的混合對照品溶液,在“2.4” 項條件下進樣,記錄色譜圖。以質量濃度為橫坐標（X）,峰面積為縱坐標（Y）進行回歸,得紅景天苷、特女貞苷的回歸方程分別為Y=1.354×107X+4 479.98（r=0.999 8）；Y=1.356 5×107X+29 081.9 （r=0.999 9）。結果表明紅景天苷、特女貞苷分別在 2.956～118.2、12.46～498.2 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL,在“2.4” 項條件下連續進樣6次,測得紅景天苷、特女貞苷峰面積RSD均為0.1%,表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗 取供試品,按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.4” 項條件下,分別于0、3、6、9、12 h進樣,測得紅景天苷、特女貞苷的RSD分別為0.3%、0.4%,表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.8 專屬性試驗 取酒女貞子陰性樣品,按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.4” 項條件下進樣,在與對照品色譜峰相應的位置上,無干擾色譜峰出現,表明專屬性好。

2.9 重復性試驗 精密稱取供試品6份,按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.4” 項條件下進樣,測得紅景天苷、特女貞苷含有量分別為0.299、14.871 mg/g,RSD分別為1.2%、0.6%,表明該方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含有量的供試品約0.25 g,共6份,分別精密加入5 mL混合對照溶液,按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.4” 項條件下進樣,依法測定紅景天苷、特女貞苷含有量,計算回收率,結果見表1。

表1 各成分加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.1 Results of recovery tests for various constituents （n=6）

2.11 樣品含有量測定 取實驗室不同炮制時間的酒女貞子樣品,按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.4” 項條件下進樣,依法測定紅景天苷、特女貞苷的峰面積,采用外標法計算含有量。結果發現,隨著炮制時間的延長（0～21 h）,實驗室炮制的酒女貞子樣品中紅景天苷含有量逐漸升高,特女貞苷含有量逐漸降低,21 h后兩者均降低；比值逐漸變小,見表2。

表2 炮制過程中酒女貞子成分變化（n=2）Tab.2 Constituent changes of Ligustri Lucidi Fructusduring processing （n=2）

取實驗室制備的9批補腎強身膠囊樣品和對應的酒女貞子藥材,按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.4” 項條件下進樣,依法測定紅景天苷、特女貞苷的峰面積,采用外標法計算含有量。結果表明,按照補腎強身膠囊處方計算,9批酒女貞子的特女貞苷平均轉移率為93.29%,RSD為4.88%。

取29批抽檢樣品,按“2.3” 項下方法處理,依法測定紅景天苷、特女貞苷的峰面積,采用外標法計算其含有量,結果見表3。

表3 各成分含有量測定結果（n=2）Tab.3 Results of content determination of various constituents （n=2）

3 討論

3.1 提取溶劑選擇 參照相關文獻［8,11-12］,分別考察了不同體積分數甲醇、乙醇溶液的提取效果,結果表明50%乙醇效果最佳。

3.2 含有量測定限度 29批樣品中特女貞苷含有量范圍為0.60～3.62 mg/粒。根據2015年版《中國藥典》 的規定,以9批實驗室制備樣品的平均轉移率為轉移率,暫定特女貞苷含有量為每粒不得少于0.65 mg,29批樣品中僅有1批未達到標準,表明各企業對特女貞苷含有量控制較好。

3.3 酒女貞子炮制程度分析 3批實驗室炮制女貞子的研究表明,1#和3#女貞子炮制9 h,2#炮制6 h后性狀符合法定標準,與文獻［8］的結果不一致,可能是黃酒用量、蒸氣壓力等因素的差異所致。將酒女貞子和對應樣品的比值進行配對樣本t檢驗,表明95% 置信區間內兩者無顯著差異,樣品中的比值可反映原料的炮制程度。參照文獻［8］,暫定樣品比值不大于8,29批樣品中有15批大于8,且企業A、F不同批次差異較大,表明各企業存在較大的酒女貞子炮制不足的風險。

3.4 企業調研 調研結果表明：企業A 1～4號樣品女貞子炮制時用酒量大于其他批,故比值遠小于其他批；企業C、D炮制時酒蒸分別3、4～6 h,比值小于8,炮制效果較好；企業I炮制時酒蒸僅為10～15 min,比值大于8,炮制效果不佳；其余企業均直接采購酒女貞子藥材,其法定標準與女貞子相差無幾,故市場上原料炮制程度千差萬別。因此,建議在補腎強身膠囊標準中新增比值用于評估女貞子炮制程度的指標,敦促各企業制定科學規范的炮制工藝,有效控制產品質量。