石香薷精油成分分析及其抗菌抗氧化活性

劉夢婷，羅飛亞，曾建國

（湖南農業大學，中獸藥湖南省重點實驗室，獸用中藥資源與中獸藥創制國家地方聯合工程研究中心，湖南長沙 410128）

飼料在長期貯存中易產生氧化、腐爛及霉變現象,導致其營養價值降低［1］。為了延長飼料的貯存時間,常常在飼料中添加抗氧化劑、防腐劑和防霉劑,但目前使用的飼料添加劑多是化學類添加劑［2-3］。由于過多地使用此類添加劑,動物源食品已經嚴重受到污染,進而影響到人類的健康。而植物精油是從從植物中提取的一類天然物質,不僅具有較強的抗菌抗氧化作用［4-5］,更由于其綠色安全的特點被越來越多的人關注。研究表明,在仔豬飼料中添加牛至油,可提高平均日增重,同時提高飼料轉化率,且治療仔豬下痢也有很好的療效［6］。在肉雞基礎日糧中分別添加植物精油,對42 d齡肉仔雞的血清抗氧化指標有正向調節作用,表明植物精油在清除自由基方面有一定的作用［7］。柴向華等［8］通過測定抑菌圈等體外抑菌實驗研究了羅勒精油、百里香精油、牛至精油等13種植物精油對6種常見有害微生物的抑菌作用。結果表明,13種植物精油均對細菌、真菌、霉菌具有一定的抑殺能力。因此,植物精油的開發和應用前景十分廣闊。

石香薷Mosla chinensisMaxim.系唇形科石薺苧屬一年生草本植物,有細葉香薷、小香薷、野香薷等別稱,廣泛分布于我國長江以南地區。石香薷在民間以全草入藥,具有治療中暑發熱、感冒惡寒、胃痛嘔吐、急性腸胃炎、痢疾等作用［9］。石香薷精油是從石香薷全草中提取的揮發油,具有濃烈的香氣。研究表明石香薷精油具有較強的抗菌和抗氧化活性［10-11］,目前對石香薷精油的應用報道主要集中在植物殺蟲劑方面［12-13］,但其在飼料添加劑方面的應用報道較少。本研究通過GC-MS法分析石香薷精油中的化學成分,并研究其抗菌、抗氧化活性,旨在尋找一種天然高效的飼料添加劑,同時也為充分開發利用石香薷提供新思路。

1 材料

1.1 儀器 98-1-B型電子調溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；PL203電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；UV2400型紫外可見分光光度計（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；Nano Quant infinite M200Pro TECAN酶標儀（瑞士Tecan公司）；ZHWY-103D型臺式恒溫振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）；SPX-150型生化培養箱（北京市永安光明醫療儀器廠）；LDZF-75KB-Ⅱ型立體蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；GCMS-QP2010型氣相色譜-質譜聯用儀、GC/MS solution色譜工作站和NIST.17質譜數據庫（日本島津公司）；移液槍（Gilson PIPETMAN?L手動單道移液器,法國Gilson公司）。

1.2 材料 石香薷干燥全草（湖南新寧）,經湖南農業大學曾建國教授鑒定為正品。DPPH （50 mg/瓶）、總抗氧化能力檢測試劑盒（FRAP法）（上海碧云天生物技術有限公司）；吐溫-80；無水硫酸鈉（分析純,500 g/瓶,國藥集團化學試劑有限公司）；沒食子酸丙酯 （PG,化學純,100 g/瓶）、抗壞血酸 （Vc,1 g/瓶,阿拉?。?；正己烷（色譜純,德國Merck公司）；無水乙醇（分析純,國藥集團化學試劑有限公司）；TPYPTONE （胰蛋白胨）、YEAST EXTRACT （酵母粉）,均購于美國OXOID公司；氯化鈉（分析純）、瓊脂粉（國藥集團化學試劑有限公司）。大腸桿菌（Escherichiacoli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、腸炎沙門氏菌（Salmonellaenteritidis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）,所有供試菌種均來自中國典型培養物保究藏中心（CCTCC）。鹽酸金霉素（純度94.1%,生產批號130306-201419,中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法

2.1 石香薷精油提取 將石香薷干燥全草切斷（1 cm左右）,稱取200 g,用水蒸氣蒸餾裝置提取樣品中的精油,同時考察時間對精油提取的影響；將精油收集后用無水硫酸鈉干燥并裝瓶于低溫處保存備用。

2.2 石香薷精油成分測定 CD-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm）；進樣口溫度240 ℃；注入方式無分流；載氣高純氦氣 （99.99%）；載氣氣體體積流量1 mL/min。程序升溫條件為初始溫度40 ℃,保持2 min,以2 ℃/min升至120 ℃,保持1 min,繼續以5 ℃/min升至200 ℃,保持2 min,分析檢測時間共計61 min。

離子源為EI源；離子源溫度為200 ℃；接口溫度為220 ℃；電離能量為70 eV；質荷比質量掃描范圍為m/z45～500；溶劑切除時間2.5 min,采集時間為58.5 min。

2.3 石香薷精油抗氧化活性測定

2.3.1 對DPPH·清除率 準確稱取0.019 7 g DPPH·溶解于無水乙醇中,定容于250 mL棕色量瓶中,即配制成2×10-4mol/L的DPPH·乙醇溶液,低溫儲藏備用；另取適量精油用無水乙醇溶解,分別配制成質量濃度為1、5、10、20、40、80 μg/mL的精油乙醇溶液,低溫儲藏備用。

參照文獻［14-15］中的方法。吸取2 mL 2×10-4mol/L的DPPH·乙醇溶液,再加入2 mL無水乙醇,至于具塞試管中,記作A0；另取2根具塞試管各加入2 mL 1 μg/mL的精油溶液,然后分別加入2 mL 2×10-4mol/L的DPPH·乙醇溶液、2 mL無水乙醇溶液,分別記作Ai和Aj。用力搖勻。將A0、 Ai、 Aj所表示的樣品在室溫暗處靜置反應30 min,加入比色皿中在波長517 nm處進行吸光度的測定,以無水乙醇作為對照調零,分別測出A0、 Ai和Aj所示樣品的吸光度值。同理分別測定出5、10、20、40、80 μg/mL的精油溶液的吸光度值,并用PG和Vc做陽性對照。石香薷精油的清除率（SR）計算公式為SR=（1-（Ai-Aj）/A0）×100%。

2.3.2 總抗氧化能力（FRAP法）參照文獻［16-17］進行。96孔板的每個檢測孔中加入180 μL FRAP工作液,空白對照孔中加入5 μL蒸餾水,樣品檢測孔內分別加入5 μL 0.1%石香薷精油溶液。以Trolox作為陽性對照。37 ℃孵育3～5 min在593 nm處測定其吸光度。以FeSO4標準溶液測定繪制標準曲線,樣品的總抗氧化能力以FRAP值來表示,1 FRAP值與1 mmol/L FeSO4相當。

2.4 抗菌活性 采用濾紙片擴散法［18-19］,將一定量的石香薷精油用1%吐溫-80水溶液稀釋成25%精油溶液。在無菌條件下,將濾紙片（d=6 mm）浸入已配置好的精油溶液中,取出自然風干,貼到涂抹適宜濃度菌懸液（1×106～107CFU/mL）的培養基平板上,每皿2片并以吐溫-80水溶液作對照,重復3次,37 ℃培養12 h,十字交叉法測定抑菌圈大?。?0-21］。

2.5 最低抑菌濃度（MIC）采用二倍稀釋法［22］,將石香薷精油用1% 吐溫-80水溶液稀釋成體積分數為160 μL/mL的溶液。取無菌試管10支,排成一排,編號1～10。除1號管中加入1.6 mL LB培養基,其余各管各加入1 mL。然后再加入0.4 mL精油溶液至1號管,混勻,從1號管中吸取1 mL液體加入至2號管,混勻后吸取1 mL加入3號管,以此類推,8號管中吸取1 mL液體棄去。9號管為不含精油溶液的生長對照,10號管為空白對照。然后在1～8號每管內加入菌液1 mL,使精油體積分數最終為0.125～16 μL/mL,最終菌液濃度為1×106～107CFU/mL。將接種好的試管,于37 ℃培養6 h,然后吸取100 μL涂布瓊脂平板,再于37 ℃培養12 h,觀察,無細菌生長的為最低抑菌濃度。

精確稱取鹽酸金霉素適量,制備成質量濃度為5.12 mg/mL的母液,參照石香薷精油二倍稀釋法進行稀釋,取無菌試管10支,編號1～10。使1～8號管鹽酸金霉素質量濃度最終為4～512 μg/mL,9號管為不含鹽酸金霉素溶液的生長對照,10號管為空白對照。將接種好的試管,于37 ℃培養6 h,然后吸取100 μL涂布瓊脂平板,再于37 ℃培養12 h,觀察細菌生長情況,無細菌生長的為最低抑菌濃度。

3 結果與分析

3.1 石香薷精油提取及化學成分分析 測定結果表明,石香薷精油的提取率隨著時間的延長而提高,當時間達到4 h后,提取率不再提高。本研究中石香薷精油的提取率為1.72%～1.85% （實際生產中,影響石香薷精油提取率的因素還有料液比、粉碎粒度、原料浸泡時間等）?？傠x子流圖見圖1。

圖1 石香薷精油總離子流圖

采用面積歸一化法對各積分色譜峰占總峰面積百分比進行計算,再將GC-MS獲取的石香薷精油成分的質譜數據,通過NIST.17譜庫檢索和人工仔細比對,參考文獻［11-12］,本研究從石香薷精油中共檢測出52種成分,鑒定了其中32種,見表1,相似度均達到84%以上,占總峰面積的97.84%。其中百里香酚、對傘花烴、α-松油烯、乙酸百里酚酯是其主要成分。

表1 石香薷精油化學成分鑒定結果

3.2 結果分析

3.2.1 總抗氧化能力 FRAP法測定總抗氧化能力的原理是酸性條件下抗氧化物可以還原（Fe3+-TPTZ）復合物,產生藍紫色的（Fe2+-TPTZ）,利用酶標儀測定其吸光度,其變化與還原物質的含有量呈比例關系,并在593 nm處達到最大吸收,因此可作為樣品總抗氧化能力的指標［23-24］。

由FeSO4標準曲線可知,其在0.15～1.5 mmol/L之間線性關系良好,回歸方程為Y=0.351 9X+0.019 8 （r=0.998 2）,通過對石香薷精油總抗氧化能力測定,計算得出石香薷精油的總抗氧化能力的FRAP值為327.08±1.92,結果表明石香薷精油的抗氧化能力較強。

3.2.2 DPPH·清除 由圖2可知,石香薷精油的IC50為1.92 μg/mL。石香薷精油對DPPH·的清除率與精油濃度呈現明顯的量效關系,當石香薷精油的質量濃度到20 μg/mL時,對DPPH·的清除率達到飽和,而總體來看,石香薷精油的清除率要高于同質量濃度的PG和Vc溶液?？寡趸瘎┍憩F出來的抗氧化活性大小一般是酚類＞醛類＞醇類,石香薷精油中的化學成分以百里香酚、對傘花烴、香芹酚等為主要物質,因此有較強的清除DPPH·的能力。

圖2 石香薷精油對DPPH·的清除率

3.3 石香薷精油及鹽酸金霉素的抑菌活性結果分析

3.3.1 抑菌活性 石香薷精油的抑菌活性結果見表2,石香薷精油對4種供試菌均有抑制作用,抑菌活性強弱為金黃色葡萄球菌＞腸炎沙門氏菌＞枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌,對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好,對大腸桿菌抑制效果較弱。

表2 石香薷精油對不同菌種的抑菌活性（）

表2 石香薷精油對不同菌種的抑菌活性（）

3.3.2 石香薷精油和鹽酸金霉素的MIC測定結果 表3顯示,生長對照號管供試菌種正常生長,表明1%吐溫-80溶液對其生長沒有抑制作用,空白對照管無細菌生長,表明培養基未受到污染。由于不同菌種對石香薷精油的敏感程度不同,最低抑菌體積分數也各不相同。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、腸炎沙門氏菌的MIC值為1 μL/mL,大腸桿菌的MIC值為2 μL/mL?？梢?石香薷精油對其均有良好的抑制作用。

見表4顯示,生長對照管供試菌種正常生長,表明蒸餾水對其生長沒有抑制作用,空白對照管無細菌生長,表明培養基未受到污染。由于不同菌種對鹽酸金霉素的敏感程度不同,最低抑菌體積分數也各不相同。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、腸炎沙門氏菌的MIC值分別為128、8、32、64 μg/mL?？梢?鹽酸金霉素對不同菌種的抑制效果各不相同,其中對金黃色葡萄球菌具有良好的抑制作用。

表3 石香薷精油體外對4種病原菌MIC值

表4 鹽酸金霉素對4種病原菌的MIC值

4 討論

石香薷是我國重要的一種含有較多揮發油的植物,其精油含有量隨著其生長期、部位及提取工藝的不同有較大差異［24-26］。本研究中石香薷精油的提取率為1.72%～1.85%,精油提取率較高。

本研究通過GC-MS分析石香薷精油化學成分,結果表明其成分以萜烯類為主,主要成分為百里香酚、對傘花烴、α-松油烯、乙酸百里酚酯、香芹酚等,和已報道結果相似［27-28］,張瀟月等［29］研究報道,石香薷化學成分中未檢測對傘花烴、α-松油烯、乙酸百里酚酯,而百里香酚和香芹酚含有量相對較高,可能是由于地域性差異導致?？寡趸钚詫嶒灲Y果顯示石香薷精油清除DPPH·的能力與其濃度呈現一定的量效關系,表明其有較強的自由基清除能力和抗氧化能力。通過測定石香薷精油對4種細菌的抑菌活性,發現石香薷精油對不同種類細菌具有良好的抑菌活性,尤其是對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、腸炎沙門氏菌展現出較強的抑制作用,而石香薷精油中的帖烯類物質可能在其較強的抗菌抗氧化能力而發揮主要作用［30-31］。在設置的陽性對照中,其抑菌效果不明顯,僅對金黃色葡萄球菌具有一般抑菌效果,對其他3種菌的抑制效果較差,石香薷精油抑菌效果明顯優于鹽酸金霉素。

本研究表明石香薷精油具有良好的抗菌抗氧化作用,可作為一種新的天然、綠色、無毒的飼料添加劑開發應用,前景廣闊。同時希望通過更深入的研究挖掘出更多芳香植物精油［32-33］,以便在將來替代化學類添加劑應用于人們生活中的各個領域,有利于人類健康。