枸杞類胡蘿卜素的分離純化及抗氧化活性研究

孫宇杰，趙琳， 王歲樓

（中國藥科大學工學院，江蘇南京 211198）

枸杞是常用的藥食兩用材料，具有重要的保健價值。據研究報道[1-2]，枸杞含有包括枸杞多糖和類胡蘿卜素在內的許多生物活性物質，但目前對枸杞生物活性成分的研究主要集中于對枸杞多糖的提取與利用方面，對枸杞類胡蘿卜素的研究相對較少。試驗對枸杞中類胡蘿卜素進行了初步的提取與抗氧化活性探討，旨在為枸杞綜合利用及其類胡蘿卜素開發應用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干枸杞，產地寧夏，購于南京市場，使用料理機將干枸杞破碎至粒徑比較均勻，裝入塑料自封袋，放入5 ℃冰箱中冷藏，備用。

其他試劑：石油醚、丙酮、正己烷、DPPH、β -胡蘿卜素標準品等，均為分析純；硅膠100～300 目、中性氧化鋁100～200 目。

1.2 儀器與設備

JVL-C051 型料理機、TGL-16G 型臺式離心機、RE-5205 型旋轉蒸發器、DNG-9070A 型電熱恒溫鼓風干燥箱、UV754N 型紫外可見分光光度計等。

1.3 類胡蘿卜素粗提液的制備

按前期優化試驗確定的提取方法，準確稱取1.000 g 的干枸杞碎粒，置于試管中，按照1∶20（g/mL） 料液比加入石油醚∶丙酮= 5∶1 （V/V） 混合溶劑，在45 ℃水浴下提取2 h，以轉速5 000 r/min離心5 min 后取上清液，得到枸杞類胡蘿卜素粗提液。吸取5 mL 置于25 mL 容量瓶，用提取溶劑定容，以提取溶劑調零，于波長450 nm 處測量吸光度OD 值，重復3 次作平行試驗，按下式計算類胡蘿卜素含量：

式中：C——將吸光度值代入β - 胡蘿卜素標準曲線得到的質量濃度，μg/mL；

V——定容體積，mL；

N——稀釋倍數；

m——干枸杞質量，g。

1.4 粗提液的分離純化

分別對柱層析方法及洗脫劑、柱填料、上樣量進行篩選，純化倍數按下式計算：

式中：C1——將純化后類胡蘿卜素溶液的吸光度代入β - 胡蘿卜素標準曲線，得到的類胡蘿卜素質量濃度，μg/mL；

C2——將純化前類胡蘿卜素溶液的吸光度代入β - 胡蘿卜素標準曲線，得到的類胡蘿卜素質量濃度，μg/mL；

V1——純化后類胡蘿卜素定容的體積，mL；

V2——純化后類胡蘿卜素定容的體積，mL；

m1——純化后收集的色素液旋干后測得的干燥品質量，g；

m2——純化前粗提液旋干后測得的干燥品質量，g。

1.5 抗氧化活性測定

分別參考米雪等人[3]、吳燦軍[4]的方法，測定DPPH自由基、羥自由基清除率。按下式計算：

所有試驗均重復3 次，數據為3 次試驗結果的平均值。采用Excel 2010 進行數據的匯總整理，使用Origin Pro 2016 進行標準曲線的線性擬合及制圖，應用SPSS 25 進行概率單位回歸分析和相關性分析，計算自由基的半清除率濃度IC50值并分析枸杞類胡蘿卜素質量濃度和自由基清除率的相關性。

2 結果與分析

2.1 粗提液的柱層析分離純化

2.1.1 上樣量對純化倍數的影響

上樣量對柱層析純化倍數的影響見圖1。

由圖1 可知，上樣量0.5，1.0，1.5，2.0 mL 均有純化效果，隨著上樣量從0.5 mL 增加到1.0 mL，純化效果不斷提升，但當上樣量增加到1.5 mL 后純化效果持續降低。說明在試驗條件下，當上樣量達到1.5 mL 以上時硅膠已經吸附飽和，不能很好地分離純化。因此，合適的上樣量為1.0 mL，此時純化倍數為1.10 倍。

2.1.2 洗脫劑種類對純化倍數的影響

洗脫劑種類對純化倍數的影響見圖2。

由圖2 可知，丙酮和石油醚、丙酮和正己烷的混合洗脫效果同單一丙酮的洗脫效果沒有顯著差異。但單一正己烷的洗脫效果和其他洗脫劑相比差距明顯，在柱層析過程中亦可觀察到洗脫的速度緩慢并且在硅膠柱頂端有色素殘留，產生了較大損失。因為正己烷是弱極性的有機試劑，并且在枸杞類胡蘿卜素中，分子結構含氧的類胡蘿卜素具有較強的極性，所以正己烷的洗脫能力較弱，不能很好地將含氧類胡蘿卜素從硅膠柱上洗脫下來。綜合考慮，合適的洗脫劑為正己烷∶丙酮= 1∶5 混合液，此時純化倍數為1.15 倍。

2.1.3 柱填料種類對純化倍數的影響

部分柱填料種類對純化倍數的影響見圖3。

由圖3可知，使用中性氧化鋁∶硅膠（100～200目） =2∶1 的純化效果比單獨使用這2 種柱填料的效果要好，中性氧化鋁柱效果最差。200～300 目硅膠的目數更高，吸附力更強，預測應當有更高的純化倍數。但在試驗的時候由于洗脫速度比100～200 目硅膠更慢，考慮到試驗進程，選擇了在層析柱頂部增加適當壓力加快洗脫速度，于是在同樣的洗脫劑條件下分離效果受到影響，純化倍數低于100～200 目硅膠。中性氧化鋁層析柱的洗脫速度則比100～200 目硅膠更快，樣液在柱中容易發生擴散，所以分離效果較差，試驗條件下幾乎沒有純化作用。

綜合考慮試驗過程中觀察到的分離現象和計算出的純化倍數，試驗篩選出的較為合適的柱層析條件為上樣量1 mL，以中性氧化鋁∶硅膠（100～200 目） =2∶1 （m/m） 為柱填料，丙酮∶正己烷= 5∶1 為洗脫劑。在此條件下對枸杞類胡蘿卜素粗提液進行柱層析，純化倍數可達1.15 倍，純化后的類胡蘿卜素含量為610.48 μg/g。

2.2 體外抗氧化活性評價

2.2.1 清除DPPH 自由基能力評價

枸杞類胡蘿卜素和維C 對DPPH 自由基清除率的比較見圖4。

圖4 枸杞類胡蘿卜素和維C 對DPPH 自由基清除率的比較

由圖4 可知，在1～50 μg/mL 質量濃度內，隨著質量濃度的增加，維C 對DPPH 自由基的清除率增加，并在5 μg/mL 之后增加趨勢變緩，枸杞類胡蘿卜素對DPPH 自由基的清除率雖然也在增加，但增加緩慢且清除率與維C 差距較大，質量濃度最大的50 μg/mL 組清除率只有13.9%?？梢钥闯?，枸杞類胡蘿卜素雖然具有清除DPPH 自由基的能力，但在試驗質量濃度下表現不強。

溶液質量濃度和DPPH 自由基清除率的統計學分析結果見表1。

表1 溶液質量濃度和DPPH 自由基清除率的統計學分析結果

DPPH 自由基的半清除質量濃度分別是維C 的IC50=4.98 μg/mL，枸杞類胡蘿卜素的IC50=96.53 μg/mL。由表1 的SPSS 統計分析結果可知，皮爾遜擬合優度顯著性p 值都大于0.05，說明2 個模型都能很好的擬合試驗數據，得出的IC50值有95%置信度。通過比較2 種溶液的IC50值，可認為維C 對DPPH 自由基的半清除能力是枸杞類胡蘿卜素的19.38 倍。

2.2.2 清除羥自由基能力評價

枸杞類胡蘿卜素和維C 對羥自由基清除率的比較見圖5。

由圖5 可知，僅在試驗設置的最低質量濃度1 μg/mL 組，維C 和枸杞類胡蘿卜素具有近似的清除率，之后維C 的清除率大幅上升，在40 μg/mL 之后已能將試驗條件下產生的羥自由基全部清除。而枸杞類胡蘿卜素的清除能力雖然隨質量濃度增加呈線性增加，但增加的幅度很小，質量濃度最大的50 μg/mL組清除率只有39.7%。

溶液質量濃度和羥自由基清除率的統計學分析結果見表2。

表2 溶液質量濃度和羥自由基清除率的統計學分析結果

維C 的IC50=11.60 μg/mL，枸杞類胡蘿卜素的IC50=71.32 μg/mL。表2 是對質量濃度和羥自由基清除率進行概率回歸擬合度的卡方檢驗結果?？梢钥闯?，2 個模型的皮爾遜擬合優度顯著性p 值均大于0.05，說明模型和試驗值的擬合度較好，擬合出的IC50具有95%的置信度。比較2 個IC50值，可認為維C 的對羥自由基的半清除能力是枸杞類胡蘿卜素的6.15 倍。

通過半數清除率的比較，枸杞類胡蘿卜素清除羥自由基的能力強于清除DPPH 自由基，這種差異可能是由于2 種抗氧化試驗方法的原理不同造成。對枸杞類胡蘿卜素溶液濃度和清除DPPH 自由基、羥自由基活性進行相關性分析。

不同枸杞類胡蘿卜素質量濃度與抗氧化活性相關性分析（n=7） 見表3。

表3 不同枸杞類胡蘿卜素質量濃度與抗氧化活性相關性分析

由表3 可知，枸杞類胡蘿卜素質量濃度和DPPH自由基、羥自由基清除率的相關性是顯著的正相關且差異很小。這種情況說明枸杞類胡蘿卜素的質量濃度大小對DPPH 自由基和羥自由基的清除效果影響顯著，質量濃度越大清除率也越高。但是，李洋等人[5]用石油醚提取枸杞果肉中的類胡蘿卜素，并用NKA- 12 型大孔樹脂純化得到含量為109.928 0 mg/L的枸杞類胡蘿卜素，采用FRAP 法、DPPH 法、清除羥自由基法、ABTS 法均測不到任何體外抗氧化活性。說明在體外試驗中，枸杞類胡蘿卜素的質量濃度高到一定程度時，便不再和DPPH 自由基、羥自由基清除率具有相關性。

試驗中，以DPPH 自由基清除率和羥自由基清除率建立評價體系，純化后的枸杞類胡蘿卜素表現出了一定的體外抗氧化活性，但以維C 作為對照，其體外抗氧化活性不強。由于體內抗氧化機理更為復雜，體外抗氧化活性并不能等同于體內抗氧化活性，所以盡管試驗結果顯示其體外抗氧化能力較弱，也不能直接否認其在抗氧化產品應用方面的價值。

試驗采用的2 種方法都是測定總抗氧化能力，對于枸杞類胡蘿卜素中單一組分的抗氧化能力無法評價。因此，枸杞類胡蘿卜素的抗氧化活性還需更細致到各個組分、兼顧體內和體外的研究。

3 結論

試驗用石油醚∶丙酮= 5∶1 混合溶劑在料液比1∶20，溫度45 ℃水浴加熱下提取2 h 得到枸杞類胡蘿卜素粗提物。用β - 胡蘿卜素標準品繪制標準曲線，得線性方程Y=0.169 6X+0.025 8，R2=0.999 1。根據標準曲線得出枸杞類胡蘿卜素粗提物中類胡蘿卜素含量為529.65 μg/g。

通過上樣量、洗脫劑、柱填料3 個單因素的試驗設計，選出的較優柱層析條件為上樣量1 mL，丙酮∶正己烷= 5∶1 的混合溶劑為洗脫劑，中性氧化鋁∶硅膠（100～200 目） = 2∶1 （m/m） 為柱填料。該條件下純化倍數為1.15，純化產物類胡蘿卜素含量610.48 μg/g。

純化后的枸杞類胡蘿卜素具有一定的清除DPPH自由基和羥自由基的能力，并且清除羥自由基能力要略強于清除DPPH 自由基的能力。經過SPSS 分析得到半數清除質量濃度IC50值分別是96.53 μg/mL 和71.32 μg/mL。其清除力隨著質量濃度增加而逐步增強，但與維C 的體外抗氧化能力相比則差距較大，有待做進一步研究。