InDel標記及其在食用菌研究中的應用與展望

沈秀芬，章爐軍，張美彥，尚曉冬，李 玉，于海龍*

(1上海市農業科學院食用菌研究所,農業部南方食用菌資源利用重點實驗室,國家食用菌工程技術研究中心,國家食用菌加工技術研發分中心,上海市農業遺傳育種重點開放實驗室,上海 201403；2吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心，長春130118)

綜觀世界食用菌產量發展趨勢，食用菌產量快速增長，近年來我國食用菌的生產廠家更是如雨后春筍般應運而生[1]。根據中國食用菌協會統計，截至2018年底，我國食用菌產量達到3 842.04萬t[2]，食用菌已成為我國農業種植業中繼糧食作物、蔬菜作物、果樹作物、油料作物之后的第五大農作物[3]。我國食用菌資源豐富，是與我們生活密切相關的生物資源。近年來，隨著人們對食用菌營養價值、藥用價值的開發利用不斷提高，基于分子標記QTL定位的食用菌遺傳育種已成為研究熱點之一[4]?，F代作物分子育種方法主要有：分子標記輔助育種(Molecule marker associated selection)、分子設計育種(Molecule design breeding)、轉基因育種(Genetically modified breeding)。隨著生物信息學的快速發展，分子標記輔助育種逐漸成為全世界動植物育種的重要手段[5]。

目前，分子標記技術主要經歷了三次技術革新。作為最早發展起來的以DNA-DNA雜交為基礎的第一代分子標記——限制性內切酶片段長度多態性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)，在食用菌中主要應用于遺傳多樣性和親緣關系的鑒定[6-9]。在此基礎上研發出一系列以PCR擴增技術為基礎的第二代分子標記。食用菌中，簡單序列重復(Simple Sequence Repeat，SSR)標記主要應用于遺傳育種[10-13]；簡單序列重復間區(Inter-simple sequence repeat，ISSR)主要運用在品種鑒定、遺傳多樣性、雜交育種等方面[14-15]；隨機擴增多態性 DNA 標記(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)主要應用于系統發育、種質資源多樣性、基因鑒別等研究中[16-17]?；贒NA芯片技術的單苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)被稱為第三代分子標記，具有多態性好，分辨率高等特點，有效克服了第一代和第二代分子標記在開發中面臨的因DNA序列長度影響的缺點[18-20]。InDel(Insertion-Deletion)分子標記作為一種新型分子標記，含量豐富度僅次于SNP標記，相對于SNP標記的單堿基多態性突變，InDel標記可排除單堿基的無義突變[21]。InDel分子標記是一種基于高通量測序技術的應用，開發成本較低[22]，適用于食用菌全基因組測序分子標記的開發[23]，能有效地鑒定出樣品間的親緣關系。

1 InDel 分子標記的產生機制和特點

1.1 InDel 標記產生機制

在同一物種不同個體或親緣關系較近物種的同源序列或基因組相同位點的序列中存在不同數量堿基的插入或缺失標記被稱為InDel分子標記[24]。InDel產生主要與基因組序列本身特征和DNA復制錯誤有關[25]。通過對19個人類基因座編碼外顯子序列進行研究，發現當序列中含有GTAAGT序列以及嘌呤嘧啶在樣本DNA兩條鏈上的含量不平衡時，會增加缺失突變的發生概率，因此InDel的產生類型與所在序列的堿基種類有一定關系；當突變熱點前后含有TACCRC序列和AT(A/C)(AC)GCC序列時會增加插入的發生率，而TATCGC序列會減少缺失率，GCGG序列會減少插入率也被確定[26]。有2/3的刪除會刪除重復序列，超過4/5的插入會創建重復序列，即它們是序列的復制品?；蛐蛄兄蠵oly(A/T)結構熱穩定性較低，在DNA復制過程中聚合酶容易發生復制滑移，復制滑移會導致序列發生插入/缺失突變，復制滑移幾率與序列GC堿基的含量成正相關；InDel分子標記的長度與其形成機制也有一定關系，一般來說，較長的InDel是由轉座因子復制多拷貝或者非常規重組造成的，而較短的InDel位點是由于復制滑移導致[27]。

1.2 InDel 分子標記的特點

Mills等[28]于2006年通過InDel分子標記創建了第一個人類基因組的InDel圖譜。通過對InDel位點序列分析發現，InDel分子標記可分為5種類型：(1)單個堿基插入/缺失；(2)單堿基對插入；(3)2—15 bp重復單元多堿基對插入；(4)隨機DNA片段插入；(5)轉座子插入。InDel長度變化范圍很大，插入/缺失堿基數目在1—1 000bp，但99%以上的InDel長度小于50bp，平均長度為36bp[29]。

InDel在基因組中數目眾多、分布廣泛、密度大。 InDel分布和密度僅次于SNP[30-31]，遠高于SSR。馮芳君等[32]選用‘日本晴’和‘9311’篩選得到均勻分布在染色體上的20對InDel標記和53對SSR標記，分析91份樣品的遺傳多樣性。結果表明，InDel標記相對于SSR標記具有數量多，擴增產物穩定，多態性高，易于檢測等優點。InDel標記更準確、高效，可避免由基因序列復雜性和特異性導致的分型模糊，進而縮短育種周期。與SNP標記相比，InDel標記利用瓊脂糖凝膠或者聚丙烯酰胺凝膠電泳即可進行分型檢測，方法簡便，對檢測技術和設備要求較低[33]。

1.3 InDel 標記的開發

InDel標記作為高通量分子標記仍具有以PCR(聚合酶鏈式反應)擴增技術為基礎的其他分子標記的優點。InDel標記的開發通?；谝阎幕蚪M序列，利用 Blast比對同一物種不同個體的重測序數據，尋找該物種之間的堿基序列差異，挑選InDel序列長度在5—20 bp的位點，最后在InDel位點兩側搜索合適位置設計20 bp左右長度的序列作為擴增引物[32]。大量研究表明，InDel標記具有操作簡單，重演性好，亞種間多態性高，結果準確，以及開發成本低等優點[34-35]，適用于動植物分子輔助育種、遺傳研究[36-41]等方面。因此，開發動植物中的 InDel 標記越來越受到研究者的關注，目前在醫學診斷、人類遺傳學[42-44]等領域應用廣泛。

2 InDel分子標記在食用菌遺傳育種中的應用

2.1 遺傳圖譜的構建

遺傳圖譜是進行分子標記輔助育種、基因定位、圖位克隆的重要工具,為食用菌分子生物學的深入研究提供了依據[45]。周雁等[46]利用毛木耳雜交子 APM2—16 菌絲體和成熟子實體的轉錄組為基礎，以 APM2—16 的 123 個擔孢子單核體后代為作圖群體，開發了包括 SSR、SCAR、CAPs、InDel 等一系列基因內分子標記，其中選用373 對InDel 引物進行親本單核體間的群體基因型分型和多態性分析，經遺傳連鎖分析獲得了一張由14個連鎖群組成、含有160個基因內標記的毛木耳遺傳圖譜。

Gong等[47]利用SRAP、TRAP、InDel等共524個分子標記以146株孢子單核體菌株為構圖群體，構建了一張包含13個連鎖群的高密度香菇遺傳圖譜，連鎖圖全長1 006.1 cM，標記之間的平均遺傳距離為2.0 cM，是迄今為止標記密度最飽和的香菇連鎖圖譜。在香菇遺傳作圖中，首次引入基于基因組設計的InDel標記，利用新増的InDel標記技術進行比較作圖后，發現圖譜的12個連鎖群中有2個屬于同一個連鎖群，即圖譜共包含11個連鎖群。龔文兵[48]引入基于基因組開發的InDel分子標記技術，對前期構建的香菇遺傳圖譜進行改良。根據146個F1孢子單核體菌株為作圖群體(M群體)進行連鎖作圖和基因型分析，獲得了一張高密度的香菇單核體遺傳圖譜。這表明InDel分子標記可為遺傳圖譜與基因組序列的整合提供重要依據。

2.2 對性狀標記和基因定位

功能性分子標記是建立在等位基因功能性基序中單核苷酸多態性位點功能性序列基礎上的一類新型分子標記，根據近等基因系中等位基因或關聯分析對數量性狀進行標記，利用該標記可有效提高分子標記輔助選擇育種的效率。髙質量的遺傳連鎖圖譜是解析農藝性狀遺傳的準確標尺，在食用菌研究中獲得與目的基因緊密連鎖的分子標記是分子標記輔助育種技術快速發展和高效應用的基礎。

培育出根據標記輔助選擇(MAS)加速改良性狀的新品種，是蘑菇育種家的長期以來的育種目標，但在食用菌領域尚未應用。Im等[49]利用28個InDel標記、226個SSR標記和2個交配因子，構建了白靈菇的遺傳連鎖圖譜。該圖譜由12個連鎖群組成，全長1 047.8 cM，標記之間平均相距4.09 cM?；贙NR2312減數分裂后單核細胞標記物的分離分析，共256個位點被映射。以KNR2532的4個單核細胞作為試驗菌株，與來自KNR2532的98個單核細胞雜交采用KNR2312對產量、品質、菌蓋顏色、菌齡等9個性狀進行了數量性狀定位(QTL)，為白靈菇遺傳育種奠定了基礎。利用分子標記對食用菌農藝性狀和生理特性進行標記，為F2代進行遺傳改造提供了數據資源，使育種目標更加明確。Gong等[50]基于香菇基因組重測序篩選出572個標記(包含82個InDel分子標記)，這些標記定位在12個連鎖群上，構建了長度為 983.7 cM的香菇高密度遺傳連鎖圖譜，并在此基礎上，在兩個測交群體中利用QTLs定位了62個與7項香菇子實體表型相關性狀。LI等[51]通過對89個香菇全基因組測序，使用297個分子標記(其中249個InDel標記)進行了基因分型，結果表明我國香菇品種具有豐富的遺傳多樣性、遺傳位點和種群結構；對11個農藝性狀的進一步關聯分析，為香菇分子標記輔助育種提供了有利線索。

2.3 研究近緣種屬間遺傳進化關系和品種間遺傳多樣性

迄今為止，利用InDel分子標記技術分析食用菌的遺傳進化關系未曾被報道，遺傳多樣性研究也僅于香菇。Xiang 等[52]從全國香菇主產區收集89個香菇野生菌株并構建了關聯分析群體，篩選252對InDel引物對香菇栽培群體進行遺傳多樣性分析，共檢測到800多個等位基因，其中82%具有多態性，通過InDel標記，把68株香菇劃分為四個類群。Shannon信息指數和基因多樣性的總體值分別為0.836和0.435，這表明所選香菇群體遺傳多樣性較為豐富，同時也說明InDel分子標記多態性較高，適用于食用菌遺傳多樣性研究。

3 展望

由于科學和經濟等多方面原因，分子育種在不同作物間還存在很大的差異。作為一種基因特異性分子標記，在作物育種中已開始應用于鑒定水稻[53-54]和小麥[55]特異性和偏離分析、大白菜[56]育種材料身份證的構建、基于基因組重測序的棉花[57]、黃瓜[58]、辣椒[59-60]InDel 標記開發。由于InDel位點是通過基因組同源序列比對分析獲得，但全基因組序列已知的生物物種有限，大多為模式物種或經濟作物，對于食用菌而言，僅有香菇[61]、金針菇[62]、雙孢菇[63]等30余種食用菌全基因組序列已測出[64]，大量食用菌基因組序列未知，導致在食用菌領域大規模開發與應用InDel標記存在一定的難度。

隨著基因組時代的到來，高通量測序技術的快速發展以及測序成本逐漸降低，國際公共基因序列數據庫(GenBank、EMBL、DDBJl等)序列信息將越來越豐富，為食用菌基于全基因組開發功能性分子標記提供了前所未有的機遇。為了使 InDel標記在食用菌中發揮重要作用，應結合全基因組測序、擴增子重測序等技術，根據已挖掘的調控食用菌重要農藝性狀的功能基因，開發出快速鑒定育種材料的InDel分子標記，為食用菌定向育種奠定基礎。

在已知食用菌序列中對InDel標記方法研究較少，在食用菌遺傳進化和分子輔助育種中尚未被報道，應拓展InDel標記在食用菌領域應用范圍。InDel標記能更全面地揭示MAS群體的遺傳結構，如QTL在MAS群體中的離散程度，加速遺傳進化關系研究。另外，運用自動化基因檢測手段，通過定向誘變、RNA干擾等提高基因的功能鑒定，加速食用菌分子育種產業化進程。

近年來，隨著基因組學、分子生物學、生物信息學等多組學聯合并與分子標記相結合，食用菌生理和育種方面已取得一些新的突破，相信未來會有越來越多的功能基因被挖掘，這為食用菌遺傳規律實質的解讀、開展現代分子標記輔助育種工作和生產應用等方面提供了極其廣闊的利用價值和應用前景?？梢灶A見，今后在食用菌的遺傳育種研究中，InDel標記開發的可利用資源不斷增加，InDel標記在食用菌研究領域中將會發揮更大的作用。