G蛋白偶聯受體激酶4的生物學特性及其研究進展①

李佳雨，蔣曉山

(桂林醫學院，廣西 桂林 541199)

G蛋白偶聯受體激酶(G protein-coupled receptor kinases，GRKs)屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，通過磷酸化配體激活的G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)和非GPCR底物參與組織更新、神經傳導、心血管和呼吸道平滑肌調節、水鈉平衡、激素代謝等細胞生理和病理活動[1]。迄今為止在哺乳動物中發現7個GRK成員，分為3個亞家族：①GRK1亞家族：也稱為視紫紅質激酶亞家族，包括GRK1和GRK7，特異性地分布于視網膜。②GRK2亞家族：又稱β-腎上腺素能受體激酶亞家族，包括GRK2和GRK3。③GRK4亞家族：包括GRK4、GRK5和GRK6[1]。與GRK 2/3/5/6的組織廣泛性分布不同，GRK4僅在睪丸、腦、腎和卵巢顆粒細胞等有限表達，是唯一具有4個剪接變異體的GRK分子。GRK4參與黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、代謝型谷氨酸(mGlu)、γ氨基丁酸B(GABAB)、多巴胺D1/D3和I型血管緊張素(AT1)等受體的脫敏(desensitization)[2-3]、以及原發性高血壓的發病和細胞增殖調控等重要的病理生理過程[4]。GRK4是迄今了解最少的GRK分子。筆者就近年來GRK4表達調控、生物學功能及其病理生理學作用等研究進展進行綜述。

1 GRK4的結構與分布

7個GRK成員均含有約185個氨基酸的氨基(N)端、105～230個氨基酸的羧基(C)端和之間的約270個氨基酸的激酶結構域。GRK4基因于1992年自4p16.3染色體的亨廷頓病區分離而得，全長約75 kb，包括16個外顯子，于第2(96個堿基)和第15(138個堿基)外顯子處發生可變剪接，產生4種亞型[2]：① GRK4α，即全長型，578個氨基酸。②GRK4β，缺失外顯子2 546個氨基酸。③GRK4γ，缺失外顯子15 532個氨基酸。④GRK4δ，缺失外顯子2和15，500個氨基酸(圖1)。

圖1 GRK4的結構及可變剪接示意圖

GRK4的結構與GRK2類似，包括RH結構域與激酶區C端形成一個酸性界面、激酶N端和RH結構域表面則顯堿性，在溶液中為Kd>12 μm的單體分子[5]。與GRK2/3/5/6的廣泛性組織分布不同，GRK4僅有限表達于睪丸、小腦、肺、子宮肌層、腎近曲小管和卵巢等組織(TheHumanProteinAtlas，https：∥www.proteinatlas.org/ENSG00000125388-GRK4/tissue)。GRK4能夠發生棕櫚?；揎?，過去認為它是膜蛋白[2]，但最近報道顯示，GRK4主要分布在細胞質[6-7]，其亞細胞分布及棕櫚化修飾的意義還不清楚。

2 GRK4基因表達的調控

GRK4的轉錄由一個無TATA框的啟動子驅動，核心啟動子位于5′未翻譯區前1 851～275 bp之間，遠端293 bp區含有一個強效順式作用元件，其轉錄活性在COS7、Saos-2和HEK293細胞中各不相同，提示GRK4基因的表達調控機制呈細胞特異性[8]。在人腎近曲小管細胞(RPTCs)中，c-Myc通過結合GRK4的啟動子，正性調控GRK4基因表達[9]。在小腦細胞中，RNA結合蛋白FMRP通過RGG盒與GRK4 mRNA結合，在翻譯水平上負性調控GRK4的表達[10]。

3 GRK4在高血壓發病中的作用

多巴胺受體屬于視紫紅質家族的GPCR，是控制腎小管鈉排泌的旁分泌物質，分為D1亞型(D1和D5)和D2亞型(D2、D3和D4)。在腎臟，GRK4和蛋白磷酸酶2A協同作用維持多巴胺D1受體(D1R)的磷酸化和去磷酸化水平的平衡和近曲小管的正常排鈉功能。在RPTC中GRK4α或GRK4γ組成型磷酸化D1R，通過類泛素蛋白樣(SUMO)修飾調控GRK4與受體之間的相互作用[11]。此外，長期暴露于細顆粒物(PM2.5)的SD大鼠腎臟近曲小管的GRK4表達增高、D1R表達降低，下調GRK4則逆轉D1R的表達和受損功能[12]，提示環境PM2.5影響腎臟GRK4和D1R的功能。

GRK4γ的R65L、A142V和A486V 3個SNPs位點變異與原發性高血壓密切相關[4]。GRK4γ142V轉基因小鼠的腎臟近曲小管的D1R磷酸化水平升高，鈉重吸收增強，發生鈉潴留和高血壓；GRK4γ486V小鼠的血壓對高鹽飲食敏感，腎組織NOX2、HO-2和ROS水平升高，而SOD和NOS則降低，表明486V變異者在高鹽飲食下易誘發腎臟抗氧化功能受損和高血壓[13]。

GRK4γ142V影響血管緊張素Ⅱ-1型受體(AT1R)的表達及活性。一方面，表達GRK4γ142V的胚胎胸主動脈平滑肌細胞對AT1R蛋白的降解和磷酸化水平低于GRK4γ野生型細胞，GRK4γ142V轉基因小鼠主動脈平滑肌細胞的AT1R表達與血壓及對血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑坎地沙坦的敏感性均高于GRK4γ野生型小鼠。另一方面，GRK4γ142V通過磷酸化I型組蛋白去乙?；冈黾幽I臟AT1R的表達與活性，阻斷AT1R信號或刪除I型血管緊張素Ⅱ受體基因Agtr1a則使GRK4γ142V小鼠的高血壓恢復正常[5，14]。目前尚不清楚GRK4是否能夠與血管中的AT1R相互作用、以及這種相互作用是否直接參與了血壓調節。

Meta分析顯示，GRK4基因的rs1024323位點與白種人高血壓的病因有關，但與東亞人和非洲人無關[15]。非裔美國人以GRK4γ R65L/A142V/A486V變異的數量與鹽排泄量呈負相關[16]。對韓國兒童的研究發現，GRK4γ486V兒童對高鹽飲食較敏感，其肥胖風險明顯增加[17]。

4 GRK4在抗高血壓治療中的作用

高血壓大鼠以超聲靶向微泡破壞(UTMD)技術遞送siRNA敲降腎近曲小管細胞GRK4，顯示D1R的磷酸化水平恢復、尿鈉排泄增加和血壓下降[18]。Rayner等前瞻性研究發現，GRK4、R65L和A142V的純合子雙變異高血壓患者較只有1個變異或雜合子/野生型R65L、A142V和A486V等位基因攜帶者需要更大劑量的利尿劑治療[19]。最近，一項312名高血壓患者(72名為GRK4γ野生型、240名為GRK4γ R65L/A142V/A486V變異型)參與的研究發現，攜帶變異基因的患者較野生型患者對氯沙坦治療更敏感，以A142V患者最明顯[20]。另一組日本人群(男408人，女666人；高血壓588人，血壓正常486人)的研究，同樣顯示血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(坎地沙坦、氯沙坦、替米沙坦或纈沙坦)對GRK4γ142V攜帶者的收縮壓降壓效果明顯，而對A486V患者的降壓效果則差得多[21]。這些研究表明，GRK4基因多態性測定有助于指導原發性高血壓患者的個體化降壓治療。

5 GRK4在細胞增殖與腫瘤中的作用

GRKs調控多種腫瘤的發生和發展。在卵巢顆粒細胞腫瘤中，GRK4α/β水平降低，而GRK4γ/δ升高，提示GRK4基因的可變剪接可能參與卵巢腫瘤的病理過程[22]。采用識別GRK4α/β的抗體以免疫組化方法對78例乳腺癌組織的GRK4表達進行檢測，結果30例呈強染色(38.5%)，26例弱染色(33.3%)，22例未染色(28.2%)[23]，GRK4可能通過激活ERK1/2和JNK信號通路促進乳腺癌MCF-7細胞的增殖[23]，敲低GRK4的表達則抑制MCF-7細胞生長[24]。

另外，外源性表達GRK4α抑制HEK293細胞的增殖，細胞發生G0/G1期周期阻滯和衰老樣表型改變，伴隨Cyclin A2/D1、CDK2/4/6基因表達下調和p16ink4a、p27kip1基因表達上調[7]。蛋白質組學分析顯示98種涉及細胞發育、增殖、凋亡和衰老的蛋白質表達有差異[25]。GRK4可能以p53非依賴方式抑制細胞生長和誘導細胞衰老[7，25]。

GRK4是GRK家族中迄今了解最少的分子。GRK4對腎臟多巴胺受體及AT1R信號調節失衡是原發性高血壓的發病機制之一。新近研究揭示了多個GRK4 SNPs位點與高血壓藥物治療的效果有關。同時發現GRK4在細胞增殖、分化和死亡信號調控中具有重要作用，這有待于深入研究。