細胞生物學實驗方法在創面修復研究中的應用

姜 艷 卓臣義 岑小寧 唐 強 唐習強 韋 騁 唐乾利

作者單位： 530004 廣西 南寧， 廣西大學醫學院科學實驗中心／右江民族醫學院科學實驗中心（姜艷）； 533000 廣西 百色，右江民族醫學院／桂西高發病防治重點實驗室（卓臣義， 岑小寧， 唐強， 唐習強， 韋騁， 唐乾利）

中醫學認為， 慢性難愈合創面屬于“潰瘍”范疇， 可由一種或多種因素誘發， 具有治愈困難、發病率高、 治療費用高昂等特點。 流行病學研究資料顯示， 慢性難愈合創面的發病率為1% ～2%［1］，且以糖尿病足、 壓瘡、 下肢靜脈性潰瘍最為常見，已成為臨床研究的熱點及難點。 筆者認為， 應用科學合理的實驗方法探究慢性難愈合創面修復的細胞生物學作用機制對提高慢性難愈合創面的防治效果具有重要意義， 遂于本研究中對細胞生物學實驗方法在創面修復研究中的應用進行了綜述， 以期為慢性難愈合創面的臨床治療提供參考。

1 創面修復及細胞生物學概述

1.1 創面修復概述

創面修復是指皮膚組織損傷后通過自身組織再生、 重建或人為干預而愈合的過程［2］。 創面修復過程復雜、 連續且受全身反應調節， 不僅關系到局部創面， 同時也與身體整體機能息息相關。 目前， 相關研究證實， 創面修復主要包含炎癥期、 增生期、組織重建期3 個階段， 涉及多種特定細胞的行為、形態、 功能等生物學變化， 如炎癥期主要為血液凝固及炎癥細胞遷移， 增生期主要為角質細胞、 纖維母細胞和內皮細胞的遷移、 增殖、 分化以促進新生血管、 肉芽組織形成及創面再上皮化， 組織重建期主要為細胞外基質的成熟及組織結構和功能的恢復［3］。

1.2 細胞生物學概述

細胞生物學是以細胞為研究對象， 在顯微、 亞顯微和分子水平研究細胞結構、 功能， 分析細胞間的相互作用以及各種干預手段對細胞的作用機制，從而了解生物體的生長、 發育、 分化、 繁殖、 運動、 遺傳、 變異、 衰老、 病變和死亡等生命規律的科學。 近年來， 細胞生物學發展迅速， 與分子生物學、 神經生物學和生態學并列為生命科學的四大基礎學科。 細胞生物學實驗方法包括細胞形態與結構觀察、 細胞化學分析、 細胞生理學、 細胞工程等30 多種， 適用于醫學基礎研究的各個領域， 特別是細胞生物學具有研究對象專一性、 影響因素可控性、 實驗內容獨特性等特點， 結合創面修復特征，通過細胞生物學實驗方法研究創面組織細胞的行為、 功能、 形態等特性， 可為創面修復的相關研究提供數據支持。

2 細胞生物學實驗在創面修復研究中的應用

2.1 實驗細胞

創面修復炎癥期巨噬細胞、 中性粒細胞、 淋巴細胞等多種細胞參與了創面壞死組織及炎癥細胞的清除， 增生期血管內皮細胞、 成纖維細胞、 上皮細胞、 表皮細胞等參與了新生血管的形成及創面的收縮和再上皮化， 重塑期成纖維細胞、 上皮細胞等參與了組織結構及功能的穩定［1］。 在細胞生物學實驗中， 可采用創面修復過程中所涉及的各類細胞的原代培養細胞株或連續傳代培養細胞株進行實驗研究。

2.1.1 原代細胞 原代細胞是從機體取出后分散成單細胞進行培養的細胞， 因其離體時間較短， 故遺傳性狀和體內細胞相近， 可用于細胞形態、 功能和增殖分化的研究， 如可采用原代培養的角質形成細胞［3］、 成纖維細胞［4-5］、 上皮細胞、 血管內皮細胞［6］研究創面修復增生期的部分作用機制。

2.1.2 傳代細胞 因原代細胞培養過程繁瑣、 細胞狀態多變、 實驗成本較高及易發生生長停滯、 細胞衰老死亡等特點， 實際操作中多選擇傳代細胞進行研究，如可用于創面修復、 角質形成細胞上皮細胞間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition， EMT） 研究的人永生化表皮細胞系HaCaT 細胞［7］具有與正常人角質形成細胞同等的分化特性， 可繁殖150 代以上，且不具有腫瘤特性； 人成纖維細胞系HFF、 MSU-1.1細胞可用于細胞纖維化及其產物變化的研究［6］； 小鼠胚胎成纖維細胞系BalB／3T3 和NIH／3T3 細胞可用于細胞纖維化及基因轉染與基因表達的研究［8］。

2.2 實驗方法

2.2.1 細胞生物學行為研究 細胞具有增殖、 凋亡、 遷移等多種行為， 均可用于創面的細胞實驗研究， 如創面修復炎癥期中性粒細胞、 巨噬細胞向受損部位遷移； 增生期成纖維細胞大量增殖、 合成并分泌膠原纖維和基質成分， 與新生毛細血管共同形成肉芽組織， 填補缺損創面［9］， 此過程中若成纖維細胞過度增殖， 可形成淺表性瘢痕、 增生性瘢痕甚至瘢痕疙瘩［10］。 可通過特定蛋白檢測、 細胞代謝活性及ATP 含量檢測、 活細胞熒光標記等方法研究細胞的增殖情況， 通過細胞劃痕實驗［11］、 Transwell 實驗［12］、 實時細胞追蹤實驗等研究創面修復過程中內皮細胞、 表皮細胞的遷移行為。

2.2.2 細胞生物學形態研究 越來越多的實驗證實， 創面細胞表型的改變可影響細胞的增殖， 進而影響創面修復［13］， 如炎癥期巨噬細胞發生極化，細胞表型可變為具有促炎特性的M1 型， 以及具有抑炎特性的M2 型， 兩者作用截然相反， 通過兩者含量比例控制創面的炎癥走向［14］； 創面重塑期成纖維細胞可通過轉化為肌成纖維細胞表型而影響組織的致密性和創面的收縮性［15］， 導致瘢痕的形成。 通過藥物刺激、 熒光標記、 基因干擾、 激光掃描、 透射電鏡掃描、 免疫組化等多種實驗方法觀察創面相關細胞的形態、 表型、 結構等， 以預測創面的發展方向［16-17］。

3 細胞生物學實驗示例

近年來， 皮膚再生醫療技術（moist exposed burn therapy／moist exposed burn ointment， MEBT／MEBO）被廣泛應用于慢性難愈合創面的治療， 且唐乾利等研究學者對其進行了多項綜合臨床與基礎實驗研究， 結果證實其可改善表皮細胞超微結構， 影響細胞增殖和遷移［18-19］， 并可促進內皮細胞生長， 調控血管新生等［20-24］， 因此， 可以MEBT／MEBO為例探討細胞生物學實驗的具體應用。 如為研究MEBT／MEBO 對表皮細胞增殖與遷移行為的影響， 可通過細胞劃痕實驗觀察MEBO 作用后的人永生化表皮細胞系HaCaT 細胞或原代成纖維細胞的變化情況； 為明確MEBT／MEBO 對細胞纖維化的影響， 可通過實驗檢測MEBO 干預后的成纖維細胞系HFF 細胞的纖維化產物變化情況。

4 小結與展望

細胞生物學實驗可通過細胞形態、 結構與功能等的研究探索創面修復規律， 且細胞生物學實驗方法較多， 不僅能夠研究創面修復過程中表皮細胞增殖、 分化等的生物學行為， 而且還可通過不同信號通路及其交互作用研究某種藥物或技術在創面修復過程中的分子生物學作用機制， 為部分醫療技術的臨床應用提供理論依據。