液相色譜-串聯質譜法測定飼料中喹噁啉類藥物的不確定度評價

賈 錚，李 蘭，趙根龍，周 劍，肖志明，李 陽，樊 霞

（中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，國家飼料質量監督檢驗中心（北京），北京 100081）

喹噁啉類化合物（Quinoxaline，QELs）是一類具有抗菌活性的物質，代表性藥物主要有喹乙醇、卡巴氧、乙酰甲喹和喹烯酮，均屬于化學合成喹噁啉-1，4-二氧化合物[1]，自20 世紀70 年代以來已被廣泛用于畜禽養殖生產中[1]。隨著人們對喹噁啉類化合物認識的深入，其毒性作用對動物帶來的損害以及造成食品安全的風險越來越受到廣泛的關注[2]。2017 年“3.15”媒體曝光了部分廠商存在超范圍、超劑量使用藥物飼料添加劑，其中喹乙醇榜上有名。為配合農業行政主管部門迅速、有效地打擊飼料生產和養殖環節違法使用喹噁啉類獸用抗菌藥物的行為，有必要對飼料中此類藥物檢測方法的不確定度進行準確評定，以提高測量的準確性和精密度，為此類藥物的監管提供相應的技術支撐。

喹噁啉類物質含量的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[3-4]和高效液相色譜串聯質譜法（HPLCMS/MS）[5-8]，本文參考《化學分析測量不確定度評定》（JJF 1135-2005）[9]和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1-2012）[10]，在采用標準方法《飼料中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇的測定液相色譜-串聯質譜法》（農業部2086 號公告-5-2014）[11]進行試驗的基礎上，優化試驗操作步驟，并對配合飼料中4 種喹噁啉類藥物含量進行添加回收試驗，對檢測方法的不確定度來源、評價、合成以及量值結果進行探討，建立該方法的測量不確定度模型，對方法不確定度進行定量計算，為相應檢測數據的正確評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑 色譜級乙腈、甲醇、甲酸（Fisher 公司）；鹽酸、二甲亞砜、磷酸二氫鉀均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；HLB 固相萃取小柱（200 mg，6 mL）（美國Waters 公司）；標準品卡巴氧（Carbdox）（純度≥99%）、喹乙醇（Laguindox）（純度≥99%）、喹烯酮（Qaincetone）（純度≥98.5%）（Sigma-Aldrich 公司），乙酰甲喹（Meguindox）（純度≥99.8%）（加拿大TRC公司）。

1.1.2 主要儀器 液相色譜-串聯質譜儀：Finnigan TSQ Quantum Discovery Max（美國Thermo 公司）、3K15型離心機（美國Sigma 公司）、Eyela MG-2200 型氮吹儀（東京理化器械株式會社）、BP310s 型電子天平（賽多利斯公司）、BP211D 型電子天平（賽多利斯公司）、Q2-866 型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、SK3300 型超聲清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）。

1.2 混合標準溶液配制 準確稱取卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇各10 mg（精確至0.01 mg）于100 mL棕色容量瓶中，加入20 mL 二甲亞砜使固體溶解完全，之后用乙腈定容至刻度，混勻，轉移至試劑瓶，于-20℃冰箱內避光保存。作為4 種喹噁啉類獸藥的混合標準儲備液，該溶液中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇濃度均為100 μg/mL，準確移取混合標準儲備液1 mL 于100 mL 容量瓶內，用乙腈稀釋至刻度作為混合標準工作液，該溶液中4 種化合物濃度為1 μg/mL。

1.3 樣品提取 準確稱取飼料樣品2 g（精確至0.001g），置于50 mL 聚乙烯離心管中，加入0.1%甲酸-乙腈溶液10 mL，渦旋混合1 min，超聲提取10 min，取出后放入離心機以9 000 r/min 離心5 min，收集上清液于50 mL聚乙烯離心管中；按照上述步驟重復提取1 次，合并提取液，混勻。準確量取5.0 mL 提取液（為分取液）于10 mL 試管中，60℃下氮氣吹至約2 mL，加入4.0 mL 0.1 mol/L 磷酸二氫鉀充分溶解，備用。

1.4 樣品凈化 選用6 cc HLB 固相萃取柱對提取液進行凈化，分別用3 mL 甲醇、3 mL 水活化固相萃取柱，將1.3 樣品提取液過柱，控制過柱速度在1 mL/min 以內，以3 mL 0.02 mol/L 鹽酸和3 mL 5%甲醇溶液淋洗固相萃取柱，擠干，以5 mL 甲醇洗脫2 次，收集并合并2次洗脫液，于60℃下氮氣吹干。準確加入20%乙腈溶液1 mL，超聲5 min，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm 濾膜，待測。

1.5 基質匹配標準溶液 稱取空白配合飼料樣品，按1.3～1.4 步驟操作制得1 mL 空白基質樣品溶液，分別移取適量的卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇混合標準工作液，60℃下氮氣吹干后，加入1 mL 空白基質樣品溶液溶解，配制成濃度為200 ng/mL 的基質匹配標準溶液，超聲5 min 溶解殘余物，渦旋1 min，經0.22 μm濾膜過濾后供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.6 儀器分析條件

1.6.1 液相色譜條件 色譜柱：C18 柱，50 mm×2 mm，2.1 μm，美國Thermo 公司；柱溫：30℃；流動相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.2 mL/min；進樣量：10 μL。

1.6.2 質譜條件 離子源：ESI；電噴霧電壓：4 000 V；霧化溫度：350℃；輔助氣流速：8 L/min；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：SRM。

2 結果與分析

2.1 數學模型 對基質匹配標準溶液進樣，以峰面積為縱坐標、基質匹配標準溶液濃度為橫坐標，采用單點法對樣品進行定量。以試驗前處理步驟和儀器條件對添加一定濃度各化合物的配合飼料樣品進行測定，平行測定6 次得到各化合物含量的平均值分別為卡巴氧0.334 mg/kg、乙酰甲喹0.342 mg/kg、喹乙醇0.455 mg/kg、喹烯酮0.379 mg/kg。

試樣中待測物質含量X（mg/kg）的計算公式：

式中，A為試樣溶液中待測藥物的峰面積；As為基質匹配標準工作液中待測藥物的峰面積；Cs為基質匹配標準工作液中待測藥物濃度（μg/mL）；V為溶解殘余物的體積（mL）；m為樣品的質量（g）；V1為分取液體積（mL）；V2為提取液總體積（mL）。

2.2 不確定度來源分析 從檢測方法可以判斷，引入不確定度因素主要有樣品質量、樣品前處理、標準溶液配制、檢測儀器、樣品的回收率以及測量重復性等，各不確定度來源因果關系見圖1。

圖1 配合飼料中4 種喹啉類獸藥含量測定的不確定來源

各影響因素相互獨立，且計算公式中各量值為乘除關系，因此合成標準不確定度可以表征：

2.3 不確定度評定

2.3.1 樣品質量m引入的不確定度 樣品質量m引入的不確定度主要包括天平校準產生的不確定度u1（m）和天平重復性產生的不確定度u2（m），試驗中使用的電子天平鑒定證書給出的重復性為1 mg，最大允許誤差為5 mg，按均勻分布考慮，6 次樣品稱量的平均值是2.019 g，則校準產生的相對標準不確定度：

2.3.2 樣品提取、凈化過程溶液體積V引入的不確定度

2.3.2.1 提取液體積 在環境溫度為20℃條件下，10 mL移液器吸取10 mL 溶液時容量允許誤差為±0.6%，則校準不確定度為：u1（V1000）=α/k=10 000×0.6%/ √—3=34.64 μL，溫度引入的不確定度：提取液為0.1% 甲酸乙腈溶液（4+6），在95%的置信系數下，溫度引起的體積變化：ΔV=V×液體膨脹系數×ΔT=7.92×0.002 07×3+0.08×0.001 03×3+12×0.001 37×3=0.098 7 mL，溫度引入的不確定度計算公式：u2（V1000）=α/k=0.098 7/1.96=50.35 μL；則10 mL 移液器引入的標準不確定度：

由此可以計算出提取液總體積V2的相對標準不確定度：urel（V2）

2.3.2.2 分取液體積 過固相萃取柱的提取液體積 使用了5 mL可調節移液器，其不確定度：u1（V5000）=α/k=，溫度引入的不確定度：ΔV=V× 液體膨脹系數× ΔT=1.98×0.002 07×3+0.02×0.001 03×3+3×0.001 37×3=0.024 7 mL，溫度引入的不確定度計算公式：u2（V5000）=α/k=0.024 7/1.96=12.6 μL，則相對標準不確定度為：

2.3.2.3 定容體積 定容體積V使用了1 mL 可調節移液器，其不確定度：u1（V5000）=α/k=1 000×0.6%/√—3 =3.464 μL，溫度引入的不確定度：ΔV=V×液體膨脹系數×ΔT=0.80×0.001 80×3+0.20×0.001 37×3=0.005 12 mL，溫度引入的不確定度計算公式為：u2（V5000）=α/k=0.005 12/1.96=2.61 μL，則相對標準不確定度：

因此，樣品在提取、凈化過程中由體積變化引入的相對標準不確定度：

2.3.3 標準溶液濃度 引入的不確定度

2.3.3.1 標準品純度引入的不確定度 由對應標準物質證書查得，卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮的相對擴展不確定度均為±1.0%，包含因子k=2，則其相對標準不確定度：urel（p）=1.0%/2=0.005；乙酰甲喹的相對擴展不確定度為0.3%，包含因子k=2，則相對標準不確定度： urel（V3）=0.3%/2=0.001 5。

2.3.3.2 標準品稱量m引入的不確定度 包括天平校準產生的不確定度u1（ms）和天平重復性產生的不確定度u2（ms），試驗中使用的電子天平鑒定證書給出的重復性為0.05 mg，最大允許誤差為0.05 mg，按均勻分布考慮，則校準產生的相對標準不確定度：

2.3.3.3 定容體積引入的不確定度 包括容量瓶校準引入的不確定度u1（V100）、溫度引入的不確定度u2（V100）、容量瓶估讀誤差引入的不確定度u3（V100）。根據《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196-2006）[12]規定，100 mL容量瓶的允差為±0.10 mL，按均勻分布考慮，引入的不確定度：u1（V100）=0.10 mL/=0.057 7 mL。

用水對100 mL 容量瓶進行10 次的定容和稱量試驗，得到標準偏差為0.06 mL，則標準不確定度：u（1V100）

測定時的試驗環境為23℃，與容量瓶校準時的溫度（20℃）相差3℃，乙腈的膨脹系數（20℃）為0.001 37，在95%的置信系數下，溫度引起的體積變化：ΔV=V×液體膨脹系數×ΔT=100×0.001 37×3=0.411 mL，溫度引入的不確定度：u2（V100）=α/k=0.411/1.96=0.209 7 mL；從而得到100 mL 容量瓶的合成標準不確定度：

相對標準不確定度為：urel（V100）=u（V100）/100=0.217/100=0.002 183。

2.3.3.4 稀釋引入的不確定度 根據《移液器計量檢定規程》（JJG 646-2006）[13]，在環境溫度為20℃條件下，1 mL移液器吸取1 mL 溶液時容量允許誤差為±1.0%，則校準不確定度：u1（V1）=α/k=1 000×1.0%/=5.775 μL。

溫度引入的不確定度計算公式：u2（V1）=α/k=100×0.001 37×3/1.96=0.209 7 μL。

則1 mL 移液器引入的標準不確定度：

相對標準不確定度：ure（lV1）=5.779/1000=0.005 779。

100 mL 容量瓶體積的不確定度分析同2.3.3.3 中容量瓶體積不確定度的計算，得到urel（V100）=0.002 183 mL。

稀釋過程按1:100 稀釋，引入的相對標準不確定度：

標準溶液引入的相對標準不確定度：

經過計算，得到因標準溶液引入的卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮的相對標準不確定度urel（Cs）=0.010 27，乙酰甲喹urel（Cs）=0.009 103。

2.3.4 重復性引入的不確定度 測量重復性引入的不確定度主要受實驗人員的熟練程度、儀器自身性能等因素影響，包括稱量的重復性、樣品提取和凈化過程中溶液體積變化的重復性、儀器檢測的重復性等，均屬于A類不確定度。本試驗將6 次平行測定的各組分含量值帶入貝塞爾公式，計算4 種化合物的標準偏差、標準不確定度和相對標準不確定度，結果見表1。

2.3.5 添加回收率R 引入的不確定度 由表2 可見，6 次樣品添加回收試驗得到的卡巴氧、乙酰甲喹、喹乙醇和喹烯酮的添加回收率分別在80.7%～89.5%、80.9%～96.0%、87.2%～94.4%、85.5%～101.3%。

采用t檢驗法對各化合物平均回收率與1.0 進行顯著性檢驗，代入公式t=/－ 1.0//S（R）計算各化合物t值，與t（0.05,5）=2.015 比較以確定回收率是否計入含量的計算中。4 種化合物的t值分別為卡巴氧：t=4.53，乙酰甲喹：t=2.21，喹乙醇：t=2.59，喹烯酮：t=0.82，由計算結果可知，卡巴氧、乙酰甲喹和喹乙醇3 種化合物須采用回收率因子R修正結果。

2.3.5 合成不確定度、擴展不確定度及結果表示 由公式ure（lX）=計算得到4 種喹噁啉類藥物的合成不確定度，根據《化學分析測量不確定度評定》（JJF 1135-2005）中規定的一般正態分布、95%的置信區間對應的k=2，則各化合物的擴展不確定度為U=urel××2，從而計算得到采用液相色譜-串聯質譜方法測定配合飼料中4 種喹噁啉類藥物含量不確定度的結果，見表3。

3 結 論

本研究對液相色譜-串聯質譜法測定配合飼料中4種喹噁啉類獸藥含量的測量不確定度的評定結果表明，影響測量不確定度的主要因素是測量重復性、添加回收率，其次是標準溶液配制和提取、凈化過程的溶劑體積變化，而樣品稱量過程引入的不確定度較小。因此，在實際操作過程中可以從試驗操作能力、儀器設備、測量重復性等方面考慮，通過培訓提高操作人員的檢化驗水平、增加平行樣測定次數、定期檢定儀器設備、保持HPLC-MS/MS 的靈敏度和穩定性以及嚴格控制實驗室環境等方式，盡量減小測量不確定度，從而保證檢測結果的準確性和重復性。

表1 含量測定結果數據

表2 回收率測定結果數據

表3 各組分擴展不確定度及結果表示