基于網絡藥理學知母不瓢匾┒災瘟鋪悄蠆∽饔沒制

趙燦 楊金偉 吳勇軍

摘要 目的：探討知母-黃柏藥對治療糖尿?。―M）的作用機制。方法：通過TCMSP、化學專業數據庫檢索知母、黃柏化學成分和作用靶點，并在UniProt數據庫中進行靶點與基因轉換，通過OMIM、Drugbank數據庫查詢現有DM相關基因。進而運用Cytoscape 3.7.1構建成分-靶點網絡、靶點相互作用（PPI）網絡并進行網絡拓撲分析，最后通過Omicshare進行基因GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，研究其作用機制。結果：成分-靶點網絡共有127個化合物和107個靶點，其中關鍵化合物涉及槲皮素、豆甾醇、山柰酚等。PPI網絡包含107個蛋白，其中關鍵靶蛋白涉及INS、AKT1、IL6、VEGFA、TNF等。GO功能富集分析得到2 612個條目（P<0.05），其中生物過程（BP）條目2 125個，分子功能（CC）條目138個，細胞組成（MF）條目349個。KEGG通路富集分析篩選到157個信號通路（P<0.05），涉及到MAPK信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、AGE-RAGE信號通路、胰島素抵抗等信號通路。結論：知母-黃柏中的主要治療糖尿病活性成分是槲皮素、豆甾醇、山柰酚，靶點主要涉及INS、AKT1、IL6、VEGFA、TNF等，通過MAPK信號通路、AGE-RAGE信號通路、胰島素抵抗等信號通路協同治療DM。

關鍵詞 知母;黃柏;糖尿病;網絡藥理學;靶點;基因;信號通路

Abstract Objective：To investigate the mechanism of diabetes mellitus（DM）treatment by drug pair containing Rhizoma Anemarrhenae and Cortex Phellodendri.Methods：The chemical constituents and targets of Rhizoma Anemarrhenae and Cortex Phellodendri was searched through TCMSP and chemical professional databases，and target and gene conversion were performed in the UniProt database，and existing DM related genes were checked through OMIM and Drugbank databases.Then Cytoscape 3.7.1 was used to construct a component-target network，a target interaction（PPI）network and perform network topology analysis.Finally，Omicshare was used to perform gene GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis to study its mechanism of action.Results：The compound-target network contained 127 compounds and 107 targets，and key compounds involved quercetin，stigmasterol，kaempferol，etc.The PPI network contained 107 proteins，and key target proteins involved in INS，AKT1，IL6，VEGFA，TNF，etc.The functional enrichment analysis of GO obtained 2 612 items（P<0.05），of which there were 2 125 biological process（BP）items，138 molecular function（CC）items，and 349 cell composition（MF）items.There were 157 signaling pathways（P<0.05），involving MAPK signaling pathway，fluid shear stress and atherosclerosis，AGE-RAGE signaling pathway，and insulin resistance and other signal pathways.Conclusion：The main therapeutic active compound of diabetes in Rhizoma Anemarrhenae and Cortex Phellodendri are quercetin，stigmasterol and kaempferol.The targets mainly involve INS，AKT1，IL6，VEGFA，TNF，etc.Through the MAPK signaling pathway，AGE-RAGE signaling pathway，insulin resistance and other signaling pathways，DM is co treated.s

Keywords Rhizoma Anemarrhenae; Cortex Phellodendri; Diabetes; Network pharmacology; Target; Gene; Signal pathway

中圖分類號：R285;R255.4;G350.7;R282.71 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.22.002

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）是一組由多病因引起以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，是由于胰島素分泌和（或）利用缺陷所引起[1]。屬于中醫學“消渴”范疇，病機為陰液虧損，燥熱偏勝，而以陰虛為本、燥熱為標[2]。目前西醫主要采用飲食控制、運動鍛煉、口服傳統降糖藥物、注射胰島素等手段進行治療，但不良反應多，且難以控制病情的發展。與西醫相比傳統中醫藥在整體觀的基礎上，通過辨證論處方，綜合調理機體陰陽失衡狀態，標本兼顧緩急有序，對DM治療和緩解有一定的優勢。

知母、黃柏是一種常用的經典藥對，最早出自金·李杲的《蘭室秘藏·卷下·小便淋閉門》，方名通關丸，亦名滋腎丸[3]。其中知母為百合科植物知母的干燥根莖，性寒，味苦、甘，歸肺、胃、腎經，具有清熱瀉火、生津潤燥的功能，現代研究表明知母提取物具有降低空腹血糖和提高胰島Β細胞數量[4]。黃柏為蕓香科植物黃皮樹的內皮，性寒，味苦，歸腎、膀胱經，具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解療瘡之功效，現在藥理學研究揭示黃柏有效成分具有降糖功效[5]。知母黃柏藥配伍在很多方劑中有所體現，如知柏地黃丸、滋腎通關丸等。

網絡藥理學是基于系統生物學的理論，對生物系統的網絡分析，選取特定信號節點（nodes）進行多靶點藥物分子設計的新學科[6]。網絡藥理學具有多成分、多靶點、多途徑的特點，其整體性、系統性與中藥復方多多成分、多途徑、多靶點的分析角度類同，本研究運用網絡藥理學分析知母-黃柏藥對DM病的干預的機制。從細胞分子水平為其機制試提供參考。

1 資料與方法

1.1 知母、黃柏化學成分與相關靶點獲取 通過TCMSP數據庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、（Chemistery Database）化學專業數據庫（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）及結合相關文獻確定知母、黃柏化學成分。將獲取的化學成分在TCMSP數據庫查詢其相關靶點，同時結合Uniprot數據庫（http：//www.uniprot.org），并限制為“homo sapiens”進行靶點-基因的轉換，最終獲得知母、黃柏的基因靶點。

1.2 DM已知作用靶點獲取 通過2個數據庫獲取DM已知治療靶點，一個是Drugbank數據庫（https：//www.drugbank.ca/drugs），使用關鍵詞“Diabetes mellitus”僅選擇經食品藥品監督管理局（FDA）批準用于治療DM藥物的靶點。另一個是在線孟德爾遺傳OMIM數據庫（https：//www.omim.org），通過主題詞“Diabetes mellitus”進行檢索DM相關靶點，2個數據庫查詢結果進行合并，刪除重復靶點。將獲得的DM靶點與知母、黃柏預測的作靶點進行比對，篩選共同靶點，并通過Wenny2.1.0在線軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）制作韋恩圖。

1.3 網絡模型的構建及分析 將知母、黃柏和DM共有靶點導入STRING 11.0數據庫（https：//string-db.org/）中進行檢索，選取minimum required interaction score>0.4的靶點，構建靶點相互作用（PPI）網絡，下載tsv文件，經整體后所得數據導入Cytoscape3.7.1軟件制作靶點相互作用網絡，并對進行網絡分析以設置節點大小和顏色反映Degree的大小、邊的粗細反映Combine score的大小。將上述的知母、黃柏治療DM潛在靶點數據進行整體后導入Cytoscape制作知母、黃柏成分-靶點網絡。運用軟件中的Network Analyzer插件對上述2個網絡進行拓撲分析，以Degree和betweenness centrality這2個參數作為重要考量。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 上述所得的靶點在HGNC數據庫（https：//www.genenames.org/）中進行ID轉換，即將知母黃柏與DM的共作靶點轉換成Gene stable ID，獲取的結果輸入Omicshare在線軟件（https：//www.omicshare.com/）進行分析，得到GO和KEGG富集分析的二級分類柱狀圖、氣泡圖及包含P值的結果。

2 結果

2.1 藥物化學成分數據庫與靶點預測 通過TCMSP數據庫和Chemistery Database數據庫，剔除3個重復活性成分總共檢索到272個化學成分，其中知母171個，黃柏104個。將上述的化學成分輸入TCMSP數據庫中獲取其靶點，并結合Uniprot數據庫共獲得283個靶點，其中知母137個，黃柏267個，兩藥重復267個。在Drugbank和OMIM數據庫中檢索DM全部相關靶點，并與知母、黃柏預測靶點進行比對，其中知母、黃柏兩藥共有107個潛在靶點與治療DM相關。見表1。

2.2 知母、黃柏與T2DM的交集基因 通過在線韋恩圖得出知母、黃柏與DM共有基因107個，知母與DM的共有基因63個：黃柏與DM的共有基因101個。即知母-黃柏藥對潛在作用靶點與DM相關靶點共有107個交集基因，其中知母63個占知母預測總靶點的46.0%，黃柏101個占黃柏預測總靶點的37.9%。見圖1。

2.3 網絡可視化 將上述知母、黃柏與DM共有靶點導入string11.0中構建靶點相互作用（PPI）網絡，見圖2，總共107個節點，1 378條邊，平均節點數為25.8，占總節點數的55.1%。圖中節點的大小和顏色表示Degree值的大小，節點越大、顏色由綠變紅對應的Degree值越大。邊的粗細表示Combine score，邊越粗Combine score值越大。知母、黃柏成分-靶點網絡見圖3，圖中共有234個節點（其中127個成分，107個靶點）和706條邊，紅色三角形節點代表成分，藍色圓形節點代表靶點。

2.4 網絡分析 將上述知母、黃柏的潛在靶點相互作用網絡和成分-靶點網絡進行拓撲分析，根據連接度和介度來評價節點在網絡中的重要性。在靶點相互作用網絡中，度排名靠前的是INS、AKT1、IL6、VEGFA與TNF，分別能與87、75、66、62與62個化合物相互作用，其他連接度靠前的靶點見表2。在成分-靶點網絡分析中，選取成分分析結果度靠前的結果。見表3。其中度排名前5的是quercetin、Stigmasterol、kaempferol、oleic acid與beta-sitosterol，分別能與61、26、25、19與16個化合物發生連接。

2.5 GO功能富集分析 將上述知母、黃柏DM共有靶點經Omicshare在線軟件分析，篩選P<0.05后總共得到2 612個功能，其中最顯著性相關功能條目見圖4。圖中藍色代表Biological process（BP）、橘色代表Molecular Function（MF）、綠色代表Cellular Component（CC），其中BP中富集靶基因靠前的是cellular process（102個靶基因）、response to stimulus（101個靶基因）、biological regulation（99個靶基因）、regulation of biological process（97個靶基因）、multicellular organismal process（91個靶基因）;MF中富集靶基因靠前的是誘導binding（97個靶基因）、catalytic activity（44個靶基因）、molecular function regulator（33個靶基因）、molecular transducer activity（27個靶基因）、transporter activity（18個靶基因）;CC中富集靶基因靠前的是細胞cell（99個靶基因）、cell part（98個靶基因）、organelle（79個靶基因）、membrane（73個靶基因）、organelle part（70個靶基因）等。提示DM可能與這些生物學功能有關。

2.6 KEGG通路富集分析 經Omicshare軟件在線KEGG通路富集分析，篩選P<0.05后，總共得到157條通路，其中顯著性通路見圖5、表4，圖中橫坐標表示靶點數，縱坐標表示通路名稱，顏色表示P值，P值越小顏色越偏向紅色，P值越大則越偏向藍色，其通路涉及MAPK信號通路（MAPK Signaling Pathway）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化（Fluid Shear Stress and Atherosclerosis）、AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE Signaling Pathway in Diabetic Complications）、胰島素抵抗（Insulin Resistance）、非酒精性脂肪性肝?。∟on-alcoholic Fatty Liver Disease）、癌癥中的Micrornas（MicroRNAs in Cancer）、Foxo信號通路（FoxO Signaling Pathway）等，這些通路反映了中藥多靶點參與體內多個生物學過程，同時表明知母、黃柏可能通過這些生物過程發揮其治療DM的作用。

3 討論

現代藥理學表明知母其化學成分主要為皂苷類、雙苯吡酮類、生物堿類、氨基酸類、揮發油類等化合物，具有抗血小板血栓、改善阿爾茨海默癥、抗腫瘤、抗炎、降血糖、降脂、抗動脈粥樣硬化、改善骨質疏松癥狀、抗氧化等作用，對循環系統、內分泌系統、心血管系統等疾病有一定的療效[7-8]。黃柏的主要化學成分為黃酮類和生物堿類，此外還含有黃柏酮、黃柏內酯、白鮮交酯、黃柏酮酸、青熒光酸、7-脫氫豆甾醇、p-谷甾醇、菜油甾醇等成分，具有抗菌作用為抗菌、抗心律失常、降血壓、抗消化道潰瘍、收縮或舒張腸管、促進胰腺分泌、抑制細胞免疫反應、降血糖等作用，對心血管系統、消化系統、神經系統、內分泌系統等疾病具有一定的療效[9-10]。知母-黃柏皆苦寒，兩者配合使用具有清熱生津潤燥、瀉火除蒸，屬中藥配伍“七情”中相須為用，其功效與消渴病陰液虧損，燥熱偏勝病機相對應。

本研究通過網絡藥理學來揭示知母、黃柏多成分、多靶點、多途徑治療DM作用機制。通過TCMSP、Chemistery Database、Uniprot數據庫查詢其化學成分及靶點，Drugbank、OMIM數據庫查詢DM疾病靶點，經過整理后共107個DM相關基因，將結果反向推理知母、黃柏涉及DM相關化合物，總共得到127個。對其成分-靶點網絡和靶點相互作用PPI網絡進行分析，槲皮素（Quercetin）、豆甾醇（Stigmasterol）、山柰酚（Kaempferol）度屬性排名前三，其中槲皮素（Quercetin），豆甾醇（Stigmasterol）屬黃柏主要成分，現有研究表明槲皮素能降低2型DM大鼠的血糖，其機制可能與其降低機體氧化應激水平，抑制胰島細胞凋亡及增強肝臟丙酮酸激酶活性有關[11]。Panda，M等[12]研究發現豆甾醇可降低小鼠血清葡萄糖濃度以及肝葡萄糖-6-磷酸酶活性（G-6-Pase），提升胰島素水平降低血糖。山柰酚（kaempferol）屬知母主要成分，現有研究表明山柰酚可通過促進骨骼肌中的葡萄糖代謝和抑制肝臟中的糖異生來發揮抗DM作用[13]。Sharma等[14]發現山柰酚可抑制NRK-52E和RPTEC細胞中高血糖誘導的RhoA活化，降低氧化應激，促炎細胞因子（TNF-α和IL-1β）和纖維化（TGF-β1）表達，來治療DM腎病。在靶點方面，度排前的是胰島素（INS）、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1），在DM中發展過程中胰島素不足起到決定性作用，從PPI網絡分析中INS連接度最高，從中可以表明知母、黃柏可以通過胰島素來治療DM，許麗紅等[15]研究發現Akt1是2型DM的易感基因之一。

對知母、黃柏靶點的進行KEGG通路富集中發現MAPK信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE信號通路、胰島素抵抗、FoxO信號通路、內分泌抵抗、IL-17信號通路、癌癥中的微小RNA等通路可能是知母、黃柏改善DM作用機制。這些通路已被相關文獻及臨床病例證實與治療DM有關。作為細胞重要的通路，MAPK可以上調葡萄糖轉運載體-4的表達，促進糖的吸收和利用，增加胰島素受體的敏感性，改善胰島素抵抗[16]。大量研究表明DM與氧化應激機制有關，AGE-RAGE信號通路可調節細胞內氧化應激通路[17]。胰島素是體內重要的降低血糖的激素，胰島素抵抗導致體內胰島素對葡萄糖攝取和利用的效率下降，引起血糖升高。FoxO通路介導胰島素或胰島素樣生長因子對細胞代謝，對調控機體血糖的平衡有重要作用[18]。糖類代謝與內分泌密切相關，內分泌抵抗引起體內血糖代謝相關激素（胰島素）缺乏，導致機體糖類失衡。IL-17通路誘導的細胞炎性反應，呂元軍等[19]發現IL-17可能與DM有關。另外，本次通路富集還富集了非酒精性脂肪性肝病、南美錐蟲病等疾病的多條信號通路，表明了機體內疾病之間存在相互影響。

綜上所述，通過網絡藥理學對知母-黃柏藥治療DM的機制進行研究，在多成分、多靶點的方式上與傳統靶點研究有一定的優勢，但其忽略計量大小以及成分靶點篩選標準，需要課題組后期的進一步研究。

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（2019-12-25收稿 責任編輯：蒼寧）