質譜成像技術與肝癌標志物的研究進展

李彥飛 劉敏

廈門大學附屬翔安醫院感染科，福建 廈門 361102

質譜技術的發展源于化學領域，最早用來測量離子的質荷比。在醫學領域的應用過程中，質譜成像技術(mass spectrometry imaging，MSI)與傳統檢測方法相比發揮出更為獨特的優勢，即不用向樣本中人為添加各類標記物就可以同時檢測出多種分子，并獲取空間分布信息，這對于小分子化合物的檢測尤為精準，克服了免疫方法中抗體特異性不強的瓶頸，為許多疾病的診斷及病理生理學機制的探究提供可靠的手段。

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是很多慢性肝臟疾病終末期最常見的并發癥[1]。在我國，乙型和丙型病毒性肝炎是肝硬化進展為肝細胞癌最重要的危險因素。此外，酗酒和各種代謝疾病，比如糖尿病，也是相關的危險因素[2]。肝癌由于其發病過程隱匿而大都不能早期發現和診斷，大部分患者確診時已進入晚期，失去手術機會。目前，臨床實踐中，活檢聯合影像學檢查被推薦為診斷肝臟疾病的金標準[3]。但由于肝組織活檢是創傷檢查，可能導致腫瘤細胞轉移，另外由于超聲等影像學檢查精度低，不能對早期原發灶進行精準的檢測并定位，因此，盡快找出一種作為診斷依據的可應用于臨床的肝癌標志物是亟待解決的問題。

1 質譜成像技術簡介

1.1 質譜成像技術基本原理與分類

質譜成像技術原理大體包括4步：①低溫條件制備組織切片并轉移到電導靶上,噴涂基質并干燥(制備樣本)；②用激光或離子束照射使組織和細胞表面的目標分子離子化(離子化)；③通過質譜測定這些離子化分子的質荷比(分子質量分析)；④由專門的軟件重新構建目標分子在組織中的分布圖(構建圖像)。質譜成像技術按離子化方式不同分為3類，基質輔助激光解吸電離(matrix- assisted laser desorption ionization, MALDI)，解吸電噴霧電離(desorption electrospray ionization,DESI)，二次離子質譜(secondary ion mass spectrometry，SIMS)。

在MALDI MSI中，基質擁有吸收熒光的能力，并可經由某種方式與組織樣品表面的被測分子結合。當激光束照射基質時，基質吸收激光能量，同時使得被測分子發生解吸，解吸后的被測分子與基質都已氣相化，二者之間發生質子轉移反應，再形成離子，其中大部分以準分子離子的形式存在；最后通過質譜檢測，利用專業重構程序構建分子在樣本中的分布圖譜。有多種質量分析器可以與MALDI聯合使用，常見的有飛行時間質量分析器、四極桿- 飛行時間串聯質量分析器、離子阱質量分析器和傅立葉變換離子回旋共振質量分析器。此外，MALDI還擁有較大的鹽容忍度和質量檢測范圍。

在DESI MSI技術中，首先由電噴霧制造帶電液滴，進而使樣本表面產生次級帶電液滴，這些液滴具有溶解多種分子的能力。與電噴霧離子化(electrospray ionization，ESI)產生氣相離子的方式類似，離子化分子在常壓、空氣的條件下直接進入質譜儀，完成質荷比的測量[4- 5]。DESI常與線性離子阱和飛行時間等質量分析器聯用[6- 7]，它的空間分辨率和靈敏度比MALDI MSI低，但可以在正常氣壓下使用，能夠維持被測物質原有的性質。

與上述兩種技術不同，SIMS的作用方式是讓高能初級離子撞擊樣品表面，并且進入樣本，之后將動能傳遞給被分析的原子和分子。當原子或分子得到的動能大于樣品表面的互相作用能時，次級離子就從樣品表面釋放出來。SIMS技術的優點是樣本的處理過程比較簡單，組織切片不經洗滌便可直接轉移至質譜靶板，大大降低了分子流失和移位的可能性。另外，SIMS MSI還有高空間分辨率的優勢，但其質量檢測范圍不如MALDI MSI和DESI MSI大,靈敏度隨質荷比增加而下降，當質荷比大于1 000時下降尤為明顯。

1.2 質譜成像技術數據采集和處理

質譜成像技術的兩種數據采集模式是imaging(高分辨率)和profiling(低分辨率)[8]。Imaging模式以50～200 μm大小的分辨率掃描整片組織，之后上萬個像素點按照被測物質信號強度組成圖像，表征分析物在組織表面的分布。Profiling模式通常在組織表面取5～20個直徑約1 mm的點進行檢測，其結果可以用于后續統計分析。以上兩種模式在實際檢測中常常結合使用。

實驗目的不同，樣品預處理的方式也不同，加之質譜儀的性能各有差別，因此適當的數據預處理對于質譜數據分析十分必要，這樣不僅除去了數據噪聲，也減小了系統誤差。目前應用較廣的質譜數據預處理方法包括數據約簡、譜線平滑、基線校正、標準化感興趣區分析等[9]。

2 質譜成像技術在肝癌研究中的應用

2.1 肝癌的常用診斷手段

目前對于肝癌的早期診斷主要根據血清甲胎蛋白(alpha- fetoprotein，AFP)含量高低及影像學發現的聯合檢查，確診往往需要有創的組織學活檢，比如手術活檢、CT或超聲引導下穿刺活檢等，這些手段有時會給病患帶來身體和心理上的負擔。血清肝癌標志物的檢測是常用無創性診斷之一，可以為醫生提供有利的診斷依據，但兼備高特異性及高敏感性的肝癌標志物尚不存在。臨床常用的肝癌標志物有：甲胎蛋白、扁豆凝集素結合型甲胎蛋白、谷氨酰轉肽酶(GGT)、γ- 羧基凝血酶原(DCP)，新型肝癌標志物有：磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、骨橋蛋白(OPN)、血管內皮生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子(HGF)、胰島素生長因子1(IFG- 1)，這些標志物在一定程度上可以滿足大多數臨床病例的診斷，但有證據表明，近年來一些AFP陰性或低濃度肝癌的比例不斷增多，從而降低了診斷早期肝癌的效果[10]。

2.2 質譜成像技術在肝癌診斷中的探索

2.2.1蛋白質和多肽

目前質譜成像技術在腫瘤領域的應用主要圍繞蛋白質和多肽領域，包括腫瘤標志物發現及腫瘤診斷，生存期較長及生存期較短患者的預后對照及患者對治療藥物反應的研究[11]。有學者用MALDI MSI對食管癌、結腸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌及甲狀腺癌樣本進行檢測，以期發現鑒別各類腫瘤明確的蛋白標志物[12]。雖然檢測到了某些蛋白可以作為腫瘤疾病的潛在標志物，但尚需大樣本檢驗和反復篩選，以及建立可靠的腫瘤疾病數據庫。

在肝臟腫瘤方面，有研究對肝癌患者、肝炎患者和健康對照各20例血清樣本進行雙向電泳- 質譜分析[13]，結果顯示肝炎組和肝癌組都低表達的有轉鐵蛋白、甲狀腺素運載蛋白，而在兩組均高表達的有α- 1抗胰蛋白酶、凝集素、銅藍蛋白、觸珠蛋白。此外，α- 1抗胰蛋白酶的表達在肝癌組最高，而熱休克蛋白27只在肝癌組表達。另有學者聯用同位素標記相對和絕對定量((isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ))標記技術和MALDI- TOF- MS串聯質譜技術，對20例肝癌患者和20例健康對照的血清進行差異蛋白組學分析[14]，并將文獻報道的肝癌相關標志物數據與肝癌血清差異蛋白組學數據進行對比，結果顯示與文獻報道表達水平一致的差異蛋白為6個，分別為α- 1- 抗胰蛋白酶、載脂蛋白E 、蛋白血漿銅藍蛋白、甲胎蛋白、補體C3和血清淀粉狀蛋白P片段。以尿液作為標本,有文獻報道DJ- 1蛋白、染色質組裝因子和熱休克蛋白60在肝癌細胞中均過表達[15]。在探索新型檢測技術方面，有研究者嘗試在優化免疫質譜檢測法的基礎上，用多肽抗體免疫富集- 質譜法發現了濃度為35.2 nmol/L的肝癌血清多肽標志物，初步建立了完整的血清多肽標志物的免疫質譜方法[16]，對血清中低濃度標志物的檢測有很好的啟發。

肝臟作為血清蛋白的主要合成器官，其合成的蛋白質和多肽承載著各種生命活動，病變的肝細胞和正常的肝細胞相比，有多少種差異蛋白表達目前還不清楚。一種或幾種差異蛋白的表達可能意味著疾病不同的臨床表現和病情進展。因此，通過歸納不同的肝癌臨床特點來發現新的肝癌蛋白標志物是一種可行的嘗試。

2.2.2蛋白質和多肽區分良惡性和識別轉移病灶

當在臨床上發現就診者存在肝占位或可疑肝癌的表現時，最迫切的是診斷出疾病的良惡性，其次是有沒有轉移。目前區分良惡性的手段仍是活檢。少數病例可以通過明顯的臨床癥狀和體征以及既往病史做出診斷，但仍然不能作為可靠的診斷手段。有學者嘗試用質譜分析識別肝癌特異性多肽，期望建立區分良惡性肝腫瘤的分類模型[17]。該研究用弱陽離子交換色譜磁珠分別逐一處理肝良、惡性腫瘤患者的血清樣本，并用基質輔助激光解離飛行時間質譜成像分析，結果顯示質譜成像技術有助于區分肝的良惡性腫瘤，纖維蛋白原和間- α- 胰蛋白酶抑制劑重鏈H4(inter- alpha- trypsin inhibitor heavy chain H4,ITIH4)的2型同工體可能用于診斷惡性肝腫瘤的血清標志物。

在識別有無轉移方面，PET- CT是可靠方法，但其儀器專業性強，花費高昂，暫時難以普及。有學者用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix- assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI- TOF- MS)分析肝細胞癌骨轉移患者的血清樣本66例，沒有骨轉移患者的血清72例[18]。結果有7個多肽的序列被識別，它們分別來自甲胎蛋白、凝血酶原、絲甘蛋白聚糖、 ITIH4、自噬體相關蛋白16- 2的1型同工體,以及轉甲狀腺素蛋白和纖維蛋白原β鏈，敏感性和特異度達80%以上。

相比鑒別是否發生肝癌，良惡性和轉移灶的判斷似乎難度更大，良惡性的問題還應包括判斷病理類型，轉移灶的問題則還應包括判斷是否是肝源性。肝癌細胞作為非正常細胞，其中哪些蛋白發生了變化，到底發生了哪些變化，仍然需要大量基礎和臨床的探究。

2.2.3DNA和RNA

如果蛋白質的功能受損或改變，人們自然會想到是否有核酸分子結構順序發生改變。復制、翻譯和轉錄任何環節出現不可逆差錯，都會使蛋白質表達出現異常，進而使細胞正常功能受損，甚至癌變。國外研究人員使用MALDI質譜成像對30例肝癌組織和癌旁肝硬化組織蛋白質組進行比對，結果顯示有13種蛋白質/肽類可以有效區分肝癌組織和肝硬化組織[19]，其中表達最強的是單體泛素(質荷比8565)，同時該研究還論證了泛素的增加并不是肝癌細胞內泛素基因表達上調的結果，而是通過轉錄后調控完成的，這就使蛋白質表達更加復雜。RNA修飾在肝癌發病原因中的研究尚處于初期，但以質譜成像技術為基礎所建立的RNA修飾分子譜無不顯示出其巨大潛能和敏感性，包括大家比較熟悉的5’帽子和3’多聚A結構，以及RNA剪接和編輯。除了mRNA,還有種類繁多的非編碼RNA的功能成為當下分子生物領域的熱點，其中tRNAs和rRNAs的修飾要比mRNAs的修飾更為復雜[20]，許多奧秘值得探討。

近來，DNA的損傷也成為肝癌發生的研究熱點，包括點突變、缺失、插入、倒位或轉位等。其中質譜成像聯合色譜技術正在成為研究DNA加合物譜系的重要工具，可以發現許多與生命過程相關的表型。DNA加合物是經代謝活化后的親電性物質與DNA堿基上親核位點共價結合形成的化合物，這些親電物質可由環境暴露產生，或因體內應力產生，且具有反應活性[21]。正常情況下，這種結合可以啟動DNA的修復過程，假如這類修復沒有在DNA復制前啟動,則會導致染色體重排和(或)核苷酸的替代與缺失。既往常用32P- 后標法檢測DNA加合物，質譜技術發展后，出現了靶向分析和非靶向分析兩種方法，前者首先運用質譜掃描依次檢出期望加合物，然后嘗試構建肝癌樣品的DNA加合物譜系；后者先根據DNA加合物結構的共同特征，篩選出具有判斷身份特征的化合物，再依次鑒定，最終得到樣品的DNA加合物譜系。很多經典肝癌致癌物與此有關，例如，黃曲霉毒素B1就和TP53基因的第249密碼子(249Ser)突變有關，后者易導致肝癌發生。另外，還有烷化劑、多環芳烴、雜環芳香胺等，它們通過促使DNA甲基化和氧化，使8- 羥基- 2’- 脫氧鳥苷升高，對生物體產生損傷。慢性乙型、丙型病毒性肝炎等也可通過損傷DNA誘發肝癌發生[22]。

2.2.4代謝產物

除了蛋白和核酸的檢測，多種小分子代謝物(脂質、氨基酸、單糖類、核苷酸等)在細胞的能量轉化、催化反應、信號轉導、免疫防御等生命活動中扮演重要角色，也可以用來檢測腫瘤疾病的發生發展。

有學者得出某些脂類代謝物升高與腫瘤疾病正相關的結論[23]，同時還發現高強度電場下噴涂基質有助于提高基質均勻度和質譜檢測低分子量代謝的靈敏度和檢出率。又有研究人員用超高效液相色譜串聯質譜檢測了32例肝細胞癌、30例肝硬化和25例慢性乙型肝炎的血清樣本[24]，發現比起AFP,血清脂質組學可以更好的診斷肝硬化。該方法區分肝硬化和肝細胞癌的靈敏度是78%，特異度是64%(AFP分別是38%和93%)，區分肝癌和慢性乙型肝炎的靈敏度和特異度都是100%，這些脂類包括甘油磷脂、甘油磷酸絲氨酸和甘油磷酸肌醇。脂類作為三大營養物質，在人體的多種生理生化過程中起到不可替代的作用，肝臟作為合成脂類物質的重要器官，其不同病變必然導致某些脂質的數量和功能發生不同程度的改變。某些以質譜技術為導向的代謝組學課題顯示，人血清中的膽汁酸、長鏈肉堿和小肽段都有可能將早期肝癌患者從肝硬化病例中鑒別出來[25]。此外，可以用GS/MS檢測尿液樣本中的代謝物，其中乙醇胺、乳酸、烏頭酸、苯丙氨酸和核糖的含量可以預測肝癌的復發情況[26]。

2.2.5多糖

由于很多血清糖蛋白是肝源性的，可以推斷與異常糖基化有關的肝臟疾病可以揭示糖蛋白的重要改變[27]。蛋白的糖基化主要由糖基轉移酶催化完成，使糖類化合物和蛋白質的某些氨基酸殘基之間形成糖苷鍵，主要有N- 糖基化(天冬酰胺為受體)、O- 糖基化(絲氨酸或蘇氨酸為受體)和糖氨聚糖(糖基磷脂酰肌醇錨)，其中N- 糖基化是血漿等體液中蛋白糖基化的主要方式，與肝臟腫瘤發生最為密切。有學者發明了用質譜成像繪制冰凍肝細胞癌組織和福爾馬林固定肝細胞癌的組織中N- 聚糖的二維分布的方法[28]，并用該方法評估了30多種N- 聚糖。

MALDI- MS是分析臨床樣本N- 糖組學的有效手段，并已經廣泛用于識別肝細胞癌的N- 聚糖[29]。另一研究體液多糖和糖蛋白的較為實用的技術是ESI- MS，可以用來發現某些潛在的腫瘤標志物[30]。由于幾乎所有的腫瘤標志物都是糖蛋白或糖抗原，用質譜成像分析肝癌組織切片的N- 多糖標志物將繼續進行和發展。有研究用多植物凝集素親和層析技術分別從20例肝癌和20例非癌慢性肝病患者的血清中純化N- 連接糖蛋白，并用IgY12去除血清高豐度蛋白，再進行二維電泳分析差異蛋白，最后鑒定了18個差異表達的糖蛋白和/或其異質體[31]。就性質和功能來說，這些差異性糖蛋白是急性期反應蛋白，有著蛋白酶抑制、生物轉運、凝血和纖溶等功能，從而間接說明肝癌的發生進展過程中機體產生的某些急性期反應物可能是潛在的肝癌血清標志物。

3 總結與展望

質譜成像技術利用離子質荷比對樣本直接進行分析和鑒定，使得分子檢測更加精準可靠，該技術在疾病診斷過程中的應用展現出新的活力。肝細胞癌的發生發展還有許多問題需要解答，從 DNA轉錄出mRNA，經過RNA的修飾，到之后翻譯出不同功能的蛋白質，再到蛋白質通過糖基化等修飾改變自己的活性和特點，最后代謝產生小分子化合物，以上各個生命過程中都可能發現診斷肝癌的有效標志物。質譜成像技術在理論上可以檢測以上所有生命過程中出現的物質，但尚需更多的時間和研究來建立疾病數據庫。有學者研究人中性粒細胞肽((human neutrophil peptide,HNP)在胃癌中的上調給出了一些啟發[32]，該研究基于HNPs含量在胃癌患者中升高這一事實，對其在胃癌組織中的定位和分布進行研究，最終發現MALDI- TOF- MS可以檢測HNPs的含量，并且可以作為胃癌的治療效果評估的標志物。類似的，在已發現的或未發現的多肽、脂類或多糖中，推測在肝癌組織中存在上調或下調的能用來作為評價肝癌病情狀態的指標。有學者聯合熒光差異雙向電泳和納米流動液相色譜串聯質譜發現特異蛋白14- 3- 3γ的表達與肝癌的發生相關，參與各種細胞過程和分化。此外，還發現有16種蛋白上調，14種蛋白下調，涉及包括糖酵解、脂肪酸轉運等多種代謝途徑[33]。

另外一個重要障礙是在肝癌進展期的診斷中，患者往往有多重肝功能不全，縮短了生存期，限制了治療手段的選擇。用質譜法尋找多糖譜的特點可能會使我們發現用于肝癌早期診斷的無創性診斷標志物[34]。質譜成像技術在包括肝細胞癌在內的腫瘤組織識別、亞型區分、良惡性及惡性程度區分等研究方向有廣泛而深刻的應用價值。除多肽外，脂類、多糖及其他代謝物都可用于研究腫瘤的特點，對多種分子的空間分布特征的揭示使質譜成像技術有巨大的基礎和臨床應用潛力。