葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎小鼠中TRAIL-R基因敲除對Th17細胞凋亡的影響

金穎莉，夏宣平，曹曙光，林道潑，胡定元，夏盛隆，蔣益

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 消化內科，浙江 溫州 325027）

腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosisinducing ligand，TRAIL）屬于TNF超家族成員之一，與功能性受體結合后，可激活天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）級聯反應，產生凋亡信號，選擇性誘導異常轉化的細胞發生凋亡，而對正常細胞無影響[1-3]。在人體中，TRAIL功能性受體包括TRAIL-R1和TRAIL-R2，又稱死亡受體（death receptor，DR）4和DR5，而小鼠體內僅有一種TRAIL功能性受體，即TRAIL-R，與人類DR5高度同源[4]。TRAIL-R廣泛表達于各種免疫細胞上，通過調控這些免疫細胞的增殖、活化及凋亡，在維持免疫穩態中發揮重要作用[5-8]。炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一類慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病。IBD的病因尚不明確，但免疫因素在IBD發病中起著關鍵作用[9]。KOBAYASHI等[10]報道，Th17細胞數目和活性與IBD患者腸道炎癥程度呈正相關。我們的前期研究表明TRAIL（rs1131568、rs1131579、rs1131580），DR4（rs20575、rs13278062）和DR5（rs1047266）基因多態性與漢族人群IBD的易感性密切相關[11-12]。在此基礎上，本研究進一步探討TRAIL-R基因敲除（TRAIL-R-/-）對小鼠結腸炎及Th17細胞凋亡的影響，為深入揭示TRAIL/TRAIL-R信號通路影響IBD的潛在機制提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：DSS（相對分子質量36～50 kDa）購自美國MP Biomedicals公司，小鼠外周血淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物公司，RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司，PrimeScript反轉錄酶購自日本TaKaRa公司，iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix購自美國Bio-Rad公司，胎牛血清購自美國Sigma公司，ROR-γt和IL-17A ELISA試劑盒、Caspase酶活性檢測試劑盒均購自杭州聯科生物公司。兔抗小鼠GAPDH抗體購自北京Affinity公司，兔抗小鼠IL-17A抗體購自英國Abcam公司；大鼠抗小鼠CD4抗體、大鼠抗小鼠CD4-FITC、大鼠抗小鼠IL-17A-PE及Fix & Perm試劑盒購自美國Biolegend公司；山羊抗大鼠Alexa Fluor 594熒光抗體和山羊抗兔Alexa Fluor 647熒光抗體購自美國Jackson公司。TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天公司。DAPI染色液購自美國Solarbio公司。

1.1.2 實驗動物：C57BL/6品系的TRAIL-R-/-小鼠經CRISPR/Cas9基因敲除技術獲得（上海南方模式生物科技發展有限公司）。根據小鼠TRAIL-R基因組序列，設計針對TRAIL-R基因的向導RNA（singleguide RNA，sgRNA），構建sgRNA表達質粒。將sgRNA和Cas9 mRNA顯微注射到C57BL/6小鼠受精卵中，獲得F0代TRAIL-R+/-小鼠。TRAIL-R+/-小鼠相互雜交后獲得TRAIL-R-/-小鼠。采用PCR驗證TRAIL-R+/-小鼠和TRAIL-R-/-小鼠的基因型（見圖1）。同一品系的WT小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠均在溫州醫科大學實驗動物中心SPF級環境中飼養，動物許可證號：SYXK（浙）2020-0014。

1.2 方法

1.2.1 構建DSS誘導的結腸炎小鼠模型：選擇6～8周齡、體質量20～22g的雄性TRAIL-R-/-小鼠和WT小鼠，按照隨機數字表法分為TRAIL-R-/-結腸炎組、TRAIL-R-/-對照組、WT結腸炎組和WT對照組，每組9只。根據COOPER等[13]介紹的實驗方法構建結腸炎小鼠模型：自由飲用3.5%的DSS溶液連續7 d。對照組小鼠自由飲用清水。造模后每日觀察并紀錄小鼠的體質量變化、糞便性狀和便血情況，計算小鼠的疾病活動指數（disease activity index，DAI）[14]。

圖1 PCR驗證TRAIL-R基因敲除小鼠基因型

造模第7天，采用頸椎脫臼法處死小鼠，收集外周血和結腸組織。測量全結腸長度，取部分結腸標本，常規石蠟包埋，連續切片后HE染色，在光學顯微鏡下采用組織學活動度評分（histology activity index，HAI）[15]對結腸組織進行病理學評估。

1.2.2 提取外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）和結腸黏膜固有層單個核細胞（lamina propria mononuclear cells，LPMCs）：摘取小鼠眼球取血后置于EDTA抗凝管，采用小鼠外周血淋巴細胞分離液提取PBMCs，置于1.5 mL EP管中備用。結腸組織經清洗、消化和過濾等處理，采用密度梯度離心后，提取溶液中間云霧狀層的結腸黏膜LPMCs，置于1.5 mL EP管中備用。

1.2.3 流式細胞術檢測Th17細胞的比例：將PBMCs和LPMCs分別重懸于1 mL含10%胎牛血清的RPMI l640培養基中。取200 μL的細胞懸液于96孔板中，加入1%佛波酯/離子霉素混合物2 μL、1%布雷非德菌素A/莫能菌素混合物2 μL后，置于37 ℃、5% CO2培養箱孵育5 h。PBS洗滌，加入抗小鼠FITC-CD4抗體，4℃避光孵育30 min，PBS再次洗滌后加入Fix & Perm，4℃避光孵育15 min后，PBS洗滌，加入抗小鼠IL-17A-PE，4℃避光孵育2 h后，PBS洗滌，上Cytoflex流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司），分析CD4+IL-17A+T細胞占CD4+T細胞比例。

1.2.4 RT-qPCR：分別從PBMCs和LPMCs中提取總RNA，用分光光度計檢測RNA的濃度和純度后，按PrimeScript反轉錄酶說明書操作，制備cDNA樣品。采用iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix進行RT-qPCR檢測。引物由上海生工生物工程有限公司設計合成。小鼠β-actin上游引物：5’-GGCTGTATTCCC CTCCATCG-3’；下游引物：5’-CCAGTTGGTAACGCCATG-3’。小鼠視黃酸相關孤兒受體（retinoic acid-related orphan receptor-γt，ROR-γt）上游引物：5’-CGCAGCC AGCAGTGTAAT-3’；下游引物：5’-TGACAGCATCTCGGGAC AT-3’。小鼠IL-17A上游引物：5’-GATGCTGTTGCTGCT GCTGAG-3’；下游引物：5’-GTGGAACGGTTGAGGTAGTCT GAG-3’?？偡磻w系10 μL，包括上下游引物各 0.4 μL，SYBR Green 5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.2 μL。反應條件：95℃預變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環。每個樣本3個復孔采用2-△△Ct法分析mRNA的相對表達水平。

1.2.5 Western blot檢測：采用蛋白裂解液對結腸組織進行蛋白提取，BCA法檢測蛋白濃度，蛋白樣品電泳后轉膜，5%脫脂奶粉中封閉1.5 h，封閉結束將PVDF膜放入一抗（IL-17A或GAPDH）中，4℃搖床孵育過夜，次日洗滌后在室溫下孵育二抗1 h，顯影后用Image Lab軟件進行分析。

1.2.6 ELISA測定：小鼠外周血離心后取血漿，按產品說明書檢測血漿IL-17A濃度。PBMCs和結腸組織分別經勻漿器充分勻漿后經低速離心取上清液，按產品說明書檢測ROR-γt濃度。

1.2.7 免疫熒光TUNEL檢測：留取小鼠結腸標本，制作5 μm厚度的冰凍切片，4%多聚甲醛溶液中4℃固定10 min后，用0.3% Triton X-100破膜15 min。PBS洗滌后，進行TUNEL染色。PBS洗滌后，用5%的牛血清白蛋白封閉1 h后，加入大鼠抗小鼠CD4抗體，置于濕盒中4 ℃孵育過夜。次日加入山羊抗大鼠Alexa Fluor 594熒光抗體，室溫避光孵育60 min后，依次加入兔抗小鼠IL-17A抗體、山羊抗兔Alexa Fluor 647熒光抗體和DAPI染液，最后采用激光共聚焦顯微鏡分析。

1.2.8 凋亡蛋白酶Caspase的活性檢測：整個操作過程在4 ℃環境下完成。取小鼠結腸組織，加入細胞裂解液后，用玻璃勻漿器勻漿后轉移到1.5 mL EP管中，裂解10 min后，離心15 min，取上清液。按照試劑盒說明書操作分別檢測Caspase 3、Caspase 8 和Caspase 9的酶活性。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS22.0軟件進行統計學分析。首先采用Shapiro-Wilk檢驗分析原始數據的正態性，結果顯示所有數據均呈正態或輕微偏態分布。計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析；采用Tukey’s post-hoc檢驗對組間比較進行校正，方差齊性者采用LSD-t法，方差不齊者采用Tamhane檢驗；重復測量資料比較采用重復測量方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1TRAIL-R基因敲除對小鼠結腸炎的影響 整個實驗過程中，TRAIL-R-/-對照小鼠和WT對照小鼠均未自發性出現腹瀉、便血等結腸炎癥狀，體質量均輕度增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）。造模后，TRAIL-R-/-小鼠和WT小鼠都逐漸出現大便次數增多、便血、體質量減輕等。如圖2所示，于造模第5天開始，TRAIL-R-/-結腸炎小鼠與WT結腸炎小鼠相比，上述癥狀更為嚴重，DAI顯著增高（P＜0.01）。造模第7天處死小鼠取結腸組織并測量長度。TRAIL-R-/-結腸炎小鼠與WT結腸炎小鼠相比，其結腸縮短更加明顯（P＜0.01），并且HAI評分更高（P＜0.01），表現為結腸黏膜和隱窩結構大量破壞，炎癥細胞大量浸潤，病變累及深度和范圍均顯著增加。

2.2TRAIL-R基因敲除對PBMCs和LPMCs中Th17細胞比例及活性的影響如圖3-5所示，TRAIL-R-/-對照組小鼠與WT對照組小鼠相比，PBMCs和LPMCs中Th17細胞占CD4+T細胞的比例以及ROR-γt和IL-17A的mRNA以及蛋白表達水平差異均無統計學意義（均P＞0.05）。WT結腸炎小鼠與WT對照組小鼠相比，PBMCs中Th17細胞比例顯著增高（P＜0.05），ROR-γt和IL-17A的mRNA和蛋白表達水平亦顯著增高（P＜0.05）。TRAIL-R-/-結腸炎小鼠與WT結腸炎小鼠相比，PBMCs中Th17細胞比例顯著增高（P＜0.01），ROR-γt和IL-17A的mRNA表達水平亦顯著增高（均P＜0.01），并且ROR-γt（P＜0.05）和IL-17A（P＜0.01）的蛋白表達水平也顯著增高。進一步在各組小鼠的LPMCs中對上述指標進行檢測發現，與WT對照組小鼠相比，WT結腸炎小鼠LPMCs中Th17細胞比例增高（P＜0.05），ROR-γt和IL-17A的mRNA和蛋白表達水平增高（均P＜0.05）。TRAIL-R-/-結腸炎小鼠與WT結腸炎小鼠相比，LPMCs中Th17細胞比例顯著增高（P＜0.01），ROR-γt和IL-17A的mRNA和蛋白表達水平顯著增高（均P＜0.05）。

圖2 TRAIL-R-/-結腸炎小鼠和WT結腸炎小鼠的結腸炎癥表現

圖3 流式細胞術檢測4組小鼠PBMCs和LPMCs中CD4+IL-17A+Th17細胞比例

2.3TRAIL-R基因敲除對結腸組織中Th17細胞凋亡及Caspase酶活性的影響如圖6-7所示，免疫熒光檢測發現，TRAIL-R-/-對照組小鼠與WT對照組小鼠的結腸組織中CD4+IL-17A+Th17細胞數量極少，因此本研究未對兩對照組小鼠結腸組織的Th17細胞做進一步凋亡率統計。TRAIL-R-/-對照小鼠與WT對照小鼠比較，結腸組織中Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的酶活性差異均無統計學意義（均P＞0.05）。WT結腸炎小鼠與WT對照小鼠比較，Caspase 3和Caspase 8的酶活性均顯著降低（P＜0.05），而Caspase 9的酶活性差異無統計學意義（P＞0.05）。TRAIL-R-/-結腸炎小鼠結腸組織中Th17細胞的凋亡率（30.51%±2.35%）較WT結腸炎小鼠（72.08%±2.81%）顯著降低（P＜0.01），Caspase 3和Caspase 8的酶活性也顯著降低（均P＜0.01），而Caspase 9的酶活性差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

本研究中TRAIL-R-/-小鼠在清潔級條件下能正常生長、發育和繁殖，這與之前的研究結果[16]基本相符?？诜?.5%DSS后，TRAIL-R-/-小鼠較WT小鼠發生了更加嚴重的結腸炎癥反應，這與采用TRAIL-R-/-小鼠構建其他自身免疫性疾病模型的觀察結果基本一致[6-7]。本研究在WT結腸炎小鼠與WT小鼠之間比較發現，前者的PBMCs和LPMCs中Th17細胞的比例以及IL-17A和ROR-γt的mRNA和蛋白表達水平都顯著高于后者，表明在DSS誘導小鼠發生結腸炎過程中，數目和活性增高的Th17細胞發揮致病作用，這與MA等[17]的研究結論基本一致。再將TRAIL-R-/-結腸炎小鼠與WT結腸炎小鼠進行比較發現，前者的PBMCs和LPMCs中Th17細胞的比例，以及IL-17A和ROR-γt的mRNA和蛋白表達水平都顯著高于后者，推測原因可能是：TRAIL-R基因敲除后，TRAIL-R-/-小鼠的PBMCs和LPMCs中活性異常增高的Th17細胞不能被及時清除，促炎性Th17細胞的數目增多，從而導致DSS誘導的TRAIL-R-/-結腸炎小鼠較WT結腸炎小鼠炎癥反應更為嚴重。

圖4 4組小鼠外周血（A、B）和結腸黏膜固有層（C、D）中Th17相關轉錄因子和細胞因子mRNA表達水平的的變化

圖5 4組小鼠外周血（A、B）和結腸黏膜固有層（C、D）中Th17相關轉錄因子和細胞因子蛋白表達水平的變化

越來越多的學者致力于TRAIL/TRAIL-R凋亡信號對免疫細胞的調節功能及相關機制的研究。LI等[18]在類風濕性關節炎小鼠模型中發現腹腔注射DR5受體激動劑TRA-8后，小鼠的關節炎癥狀得以明顯緩解，并且引流淋巴結中Th1和Th17細胞的數目減少，IL-17A水平顯著降低。LI等[19]還曾設計表達人/小鼠嵌合型DR5受體的轉基因小鼠，該小鼠表達的DR5受體由人DR5的胞外域、小鼠TRAIL-R的跨膜和胞內域共同組成。隨后在這種轉基因小鼠中構建膠原抗體誘導型關節炎模型，造模成功后采用特異性人DR5受體的激動劑腹腔注射治療，結果發現小鼠的關節炎癥狀明顯改善，并且在小鼠的關節炎滑膜中還觀察到，具有促炎功能的CD11b+Ly-6C+巨噬細胞的數量明顯減少。該研究進一步證實此類促炎巨噬細胞數量減少與其凋亡增加相關。IKEDA等[20]在誘導EAE小鼠模型中發現，與WT小鼠相比，TRAIL-/-小鼠會更早出現EAE癥狀，且病情更加嚴重，其機制可能與TRAIL-/-小鼠中Th1細胞的凋亡減少有關。PARK等[21]在膠原誘導的關節炎小鼠模型中發現，外源性補充TRAIL治療能上調小鼠炎性關節組織的Caspase 3，誘導Th17細胞凋亡，進而緩解關節炎癥。本研究對結腸組織中Th17細胞的凋亡率及Caspase的酶活性進行比較發現，相比于WT對照小鼠，WT結腸炎小鼠結腸組織中Caspase 3和Caspase 8的酶活性水平顯著降低，這與SETIA等[22]在DSS誘導的結腸炎小鼠中的觀察結果基本相符；繼續在TRAIL-R-/-結腸炎小鼠和WT結腸炎小鼠之間比較發現，前者的結腸組織中Th17細胞凋亡率顯著降低，Caspase 3和Caspase 8 的酶活性水平亦顯著降低，而Caspase 9的酶活性水平在2組間差異無統計意義差異。理論上，TRAIL與TRAIL-R結合后首先啟動細胞外凋亡途徑，募集Fas 相關死亡域蛋白，在細胞膜上形成死亡誘導信號復合物，激活Caspase 8，進而啟動Caspase級聯反應，最終以Caspase 3為凋亡執行蛋白，誘導細胞凋亡。而當細胞受到DNA損傷、氧化等因素刺激時，將激活線粒體參與的細胞內凋亡途徑，激活Caspase 9，最后亦通過Caspase 3誘導靶細胞凋亡。因此，本研究推測TRAIL-R基因敲除可能抑制Caspase 8和 Caspase 3介導的細胞外凋亡途徑，而不影響Caspase 9參與的細胞內凋亡途徑，造成炎性腸黏膜組織中具有促炎活性的Th17細胞凋亡減少，Th17細胞的數目和活性增高，從而導致DSS誘導的TRAIL-R-/-結腸炎小鼠較WT結腸炎小鼠更為嚴重。

圖6 免疫熒光技術檢測小鼠結腸組織中Th17細胞凋亡率的變化

圖7 4組小鼠結腸組織中凋亡蛋白酶活性水平比較

綜上所述，本研究結果表明，TRAIL/TRAIL-R通路可能通過調控Th17細胞的凋亡，影響Th17細胞的數目和活性，參與結腸炎小鼠的發病機制。