新型絲素蛋白水凝膠攜載西咪替丁預防酒精引起的小鼠急性胃潰瘍

陳翩翩，黃維潔，沈淑蓉

（溫州市中西醫結合醫院，浙江 溫州 325000，1.中藥房；2.腫瘤科）

消化性潰瘍是一種全球性的常見疾病，而胃潰瘍是消化性潰瘍中最為常見的類型[1]。胃潰瘍的病因復雜，而且為多發病，易反復發作。胃黏膜的急性損傷是胃潰瘍發生的重要原因，而針對胃潰瘍的治療主要以口服藥物為主。西咪替?。╟imetidine，CMD）為H2受體拮抗劑，能抑制基礎和夜間胃酸分泌，也能抑制由組胺、分肽胃泌素、胰島素和食物等刺激引起的胃酸分泌，并使其酸度降低，對因化學刺激引起的腐蝕性胃炎有預防和保護作用，對應激性胃潰瘍和上消化道出血也有明顯療效[2]。但是，胃黏膜黏液的更新、黏膜層的物理保護屏障、酶降解作用等，使得具有治療潛力的藥物不能到達胃黏膜損傷部位，從而降低治療的有效性，增加全身不良反應。同時，胃排空效應[3]易將治療藥物排空，難以達到有效的原位給藥預防治療效果，極大降低了藥物治療效率，增加了治療時間。

絲素蛋白（silk fibroin，SF）為一種可降解材料，且生物安全性好，提取于蠶繭[4-5]，通過脫膠提取等步驟可得到SF水凝膠。以SF水凝膠為基礎的生物黏附型水凝膠攜載CMD，將最大限度地發揮高親和性水凝膠的優勢。

針對胃內特殊生理結構特點和黏液屏障，本項目利用安全性高的生物新材料或材料新組合，制備攜載CMD的生物黏附水凝膠，構建新型胃潰瘍長效預防治療系統，充分發揮藥物與生物材料聯合應用對于胃黏膜損傷的高效預防作用。

1 材料和方法

1.1 材料 BMJ-III型病理組織包埋機（常州中威電子儀器有限公司）；旋轉型石蠟切片機（珊頓，英國）；酶標儀（BioTek，美國）；ECLIPSE NI正置熒光顯微鏡（尼康，日本）；Ti-E&A1 plus激光共聚焦顯微鏡（尼康，日本）；掃描電子顯微鏡（日立，日本）；超聲細胞破碎儀（Branson，美國）。CMD（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度99%）；SOD和MDA試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；阿利新藍-過碘酸-雪夫染色試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 CMD-SF水凝膠的制備：SF水溶液制備方法參考PIKULA等[6]的制備步驟。首先，剪開蠶繭，使其成碎片狀，稱取10 g蠶繭碎片，加入1 L 0.02 mol/L Na2CO3溶液，在100℃下煮沸1.5 h，期間更換Na2CO3溶液1次，后用蒸餾水反復沖洗，以去除絲膠蛋白，再放入烘箱干燥。烘干后，將脫膠的蠶絲纖維放入9.3 mol/L LiBr溶液中3 h，期間保持60℃恒溫水浴。最后，通過離心和過濾之后，將溶液放入透析袋中，透析3 d，以去除殘留的鹽溶液。提取的SF溶液的最后濃度約等于1.5 wt%，放于4 ℃備用。取5 mL SF溶液，混入1 g CMD，混合均勻之后，進行超聲處理，誘導CMD-SF溶液相變為CMD-SF水凝膠[7]（20%的振幅，共作用30 s，10 s作用，10 s間隙）。

1.2.2 CMD-SF水凝膠形態學表征：取適量CMD-SF溶液和CMD-SF水凝膠樣品，用液氮迅速冷凍至固態，放到冷凍干燥機中凍干48 h，呈白色粉狀，將其固定于導電片上，噴金后用掃描電鏡觀察樣品的結構與形態。同時進行FT-IR分析檢測判別CMD-SF的成膠狀態，光譜通過Excalibur Series收集，64次掃描，分辨率為4 cm-1[8]。

1.2.3 CMD-SF水凝膠的體外緩釋：通過動態透析方法檢測CMD-SF水凝膠體系對CMD的緩釋效果。首先，將CMD溶液、CMD-SF溶液以及CMD-SF水凝膠樣品分別放入透析袋中（MW，100 kDa），將透析袋放入裝有50 mL pH為7.4的PBS溶液的離心管中，接著將離心管放入37℃恒溫水浴搖床上，每個時間點取0.5 mL外界溶液，再保存在-80℃超低溫冰箱，在收集完最后一個時間點后，用紫外分光光度儀于波長218 nm波長處測定吸收度，根據標準曲線方程計算釋放液中的CMD濃度。累計釋放率=（上清液的CMD含量/原始CMD含量）×100%。

1.2.4 急性胃潰瘍模型的構建與動物分組：C57BL/6雄性小鼠32只，8周齡，由上海斯萊克實驗動物中心提供，在溫州醫科大學動物實驗中心分籠飼養，飼養室的室溫維持在（23±2）℃，濕度35%～60%，自然光照，自由飲食。適應性飼養1周后隨機分為4組，即對照組、CMD組、CMD-SF溶液組、CMDSF水凝膠組。于造模前3 d給予各組藥物進行預防治療，CMD組、CMD-SF溶液組以及CMD-SF水凝膠組灌服劑量為每天4 mL/kg，連續灌胃3 d，對照組灌服同等容積的0.9%氯化鈉溶液。于最后一次灌胃后禁食24 h，各組小鼠按15 mL/kg劑量灌胃無水酒精[9]，灌胃1 h后，致急性酒精性胃潰瘍模型。

1.2.5 原位灌胃CMD-SF水凝膠對急性胃潰瘍模型動物的預防效果：標本采集：無水酒精灌胃1 h后，處死動物，摘取全胃，沿胃大彎對半剪開，用0.9%氯化鈉溶液洗凈，將胃組織攤平，擺上標尺，在同樣的高度、視野、倍數下快速拍照記錄。然后，將一半組織平攤在錫箔紙上，浸泡于10%甲醛溶液中固定，用于組織學評價，另一半組織移入-80℃冰箱中保存，待勻漿。胃組織中SOD、MDA檢測：按照MDA、SOD試劑盒的檢測步驟對采集得到的各組小鼠胃組織中SOD、MDA的含量進行檢測。組織學評價：固定好的胃組織進行脫水，石蠟包埋，制備成5 μm切片，分別進行HE染色觀察胃組織形態學、PAS染色觀察胃黏膜的損傷情況和caspase3免疫組化染色觀察胃的細胞凋亡情況。用光學顯微鏡觀察，根據前期實驗[1]的組織學損傷評分標準對間質水腫（評分0～3）、出血損傷（評分0～3）和炎癥細胞的存在（評分0～3）進行評分。

1.3 統計學處理方法 采用GraphPad Prism5軟件進行統計學分析。計量數據以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，采用Dunnett’st檢驗進行多重比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CMD-SF水凝膠的特征 為了驗證CMD-SF水凝膠的成膠狀態，將制備得到的CMD-SF溶液和CMDSF水凝膠分別進行了掃描電鏡成像觀察顯微結構，CMD-SF溶液（見圖1a）呈細長水滴狀雜亂排列，而CMD-SF水凝膠則呈扁片狀（見圖1b），掃描電鏡成像結果與文獻報道[10-11]相同，說明CMD-SF水凝膠制備成功。通過FT-IR檢測CMD-SF水凝膠成膠狀況。SF在溶液狀和凝膠狀下，有著不同的二級結構，主要體現在SF溶液中有1 660、1 540和1 235 cm-1的特征峰，該特征峰為α-螺旋結構的特征峰，而SF凝膠中有1 630和1 530 cm-1的特征峰，該特征峰為 β-折疊結構的特征峰[12]。從圖1c可知，經過超聲處理后CMD-SF的特征峰為1 630和1 526 cm-1，具有 β-折疊的特征，而未經超聲處理的CMD-SF的特征峰為1 650和1 545 cm-1，具有α-螺旋的特征。此結果進一步確認，本實驗的超聲處理能夠誘導CMD-SF溶液向CMD-SF水凝膠轉變。

圖1 CMD-SF水凝膠的特征

2.2 CMD-SF水凝膠的緩釋 由圖1d可見，在12 h時，CMD溶液的累計釋放量約為51.6%，CMD-SF溶液的累計釋放量約為49.2%，與CMD溶液幾乎沒有差別；而CMD-SF水凝膠的累計釋放量約為31.7%，72 h時，CMD溶液的累計釋放量約為73.0%，CMD-SF溶液的累計釋放量與單純CMD的累積釋放量幾乎沒有差別，而CMD-SF水凝膠的累計釋放量約為45.4%，以上結果說明單純的SF溶液并不能有效穩定CMD，而成膠后的SF能有效穩定CMD的釋放，達到緩釋的效果，從而延長CMD的作用。

圖2 4組胃組織宏觀評價

2.3 CMD-SF水凝膠能有效預防酒精引起的急性胃潰瘍通過各組組織樣本可以看出，給予CMD-SF水凝膠預防治療，能有效減少胃出血、潰瘍的發生，并且預防效果高于CMD組和CMD-SF溶液組（見圖2）。對照組（見圖3a）的小鼠胃組織的黏膜層破損，腺體排列紊亂且形態變異，黏膜下層存在較多炎癥細胞浸潤。CMD-SF水凝膠組（見圖3d）黏膜層較為完整，腺體排列較為規整，黏膜下層幾乎未見炎癥細胞浸潤，優于CMD組（見圖3b）和CMD-SF溶液組（見圖3c）的預防效果。CMD-SF水凝膠（見圖3h）預防治療后胃組織周邊黏膜PAS染色陽性的中性黏液面積相較于對照組（見圖3e）明顯增加，說明CMD-SF水凝膠能有效緩解由酒精引起的黏膜糖蛋白的損失，能有效預防胃潰瘍的發生，而未成膠的SF溶液并不能提高CMD的治療效果。胃組織損傷評分見圖4，與對照組相比，治療組組織學損傷評分有所下降，尤其是CMD-SF水凝膠組（P＜0.01），能有效降低出血、減少炎癥細胞浸潤以及減輕間隙水腫，而CMD組 （P＜0.01）和CMD-SF溶液組（P＜0.01）的組織學損傷評分改善沒有CMD-SF水凝膠組顯著。各組胃組織樣本的PAS染色中的中性黏液水平結果示，與對照組比，CMD-SF水凝膠組的中性黏液水平顯著提高（P＜0.01），而CMD組和CMD-SF溶液組差異無統計學意義（P＞0.05），同時CMD組和CMD-SF溶液組之間幾乎沒有差別，說明SF溶液并不能提高CMD的治療效果。

圖3 4組胃組織病理染色

2.4 CMD-SF水凝膠有效預防細胞凋亡減少胃黏膜損傷 大量攝入酒精會嚴重損傷胃黏膜，導致細胞凋亡[13]，從圖5的caspase3免疫組化染色結果可以看出，相較于對照組，給予CMD-SF水凝膠，能有效降低caspase3的表達量，而給予CMD-SF溶液和CMD溶液，caspase3的表達量較對照組下降。值得注意的是，與CMD-SF水凝膠組相比，CMD-SF溶液與單純CMD溶液的預防效果差異有統計學意義，說明未成凝膠的SF溶液并不能提高CMD的預防效果。免疫印跡實驗結果表明，對照組的caspase3表達水平最高，而給予CMD-SF水凝膠治療后caspase3水平顯著下降（P＜0.01），CMD組和CMD-SF溶液組差異無統計學意義。相較于CMD-SF水凝膠，CMD組和CMD-SF溶液組的caspase3表達水平差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.5 CMD-SF水凝膠通過抑制氧化應激反應來防止胃潰瘍發生 酒精會導致胃組織中的MDA水平提高，SOD水平下降[14]，而通過給予CMD-SF水凝膠預防治療后，相對于對照組，CMD-SF水凝膠能有效提高胃組織中SOD水平（P＜0.01），而CMD組和CMD-SF溶液組與對照組比差異無統計學意義（P＞0.05）。相對于對照組，CMD-SF水凝膠能有效降低胃組織中MDA水平（P＜0.05），而CMD組和CMD-SF溶液組與對照組差異無統計學意義（P＞0.05）?？梢缘贸鯟MD-SF溶液的預防效果等同于單純的CMD溶液，說明未成凝膠狀的SF并不能協助CMD有效停留于胃黏膜處發揮長效的預防作用。

圖4 4組胃組織損傷評分和中性黏液水平

圖5 4組胃組織caspase3蛋白表達

表1 CMD-SF水凝膠對小鼠胃組織中SOD和MDA含量的影響（n=8）

3 討論

由酒精引起的急性胃潰瘍的發病率越來越高，且重癥患者多伴有出血、穿孔等并發癥，若不及時治療會導致嚴重后果[15]。應激性胃潰瘍發病機制主要為胃酸過多、幽門螺桿菌感染、胃黏膜保護機制遭到破壞，胃黏膜血流供應不足，胃酸侵蝕性增加，從而引起急性胃潰瘍[16]。CMD是臨床治療胃潰瘍的常用藥，但是單純的CMD藥物不能有效停留在胃黏膜表面發揮長效的預防治療作用。生物材料作為一種新興的手段，可以作為藥物載體，發揮其攜載、緩釋、靶向等不同作用。在眾多生物材料中，SF作為天然蛋白，有著高生物相容性，有利于細胞黏附和伸展，同時易提取且價格低等優點在生物醫學領域備受青睞[17]。

本研究采用堿提取法獲得SF溶液，再通過超聲處理獲得SF水凝膠[8，11]。通過掃描電鏡觀察制備得到的SF水凝膠的顯微結構，同時通過FT-IR檢測進一步確認SF溶液向水凝膠轉變成功。我們還利用C57BL/6小鼠構建胃潰瘍模型，應用CMD-SF水凝膠進行預防給藥，觀察對急性胃潰瘍的預防作用。結果表明，給予CMD-SF水凝膠預防能有效減少胃組織出血和潰瘍的發生。HE染色結果也說明，CMD-SF水凝膠的預防作用明顯好于CMD-SF溶液組和CMD溶液組，能有效保持黏膜層完整，腺體排列也較為規整，炎癥細胞浸潤減少。PAS染色也表明CMD-SF水凝膠能有效緩解黏膜糖蛋白的減少。Caspase3免疫組化染色結果證明，CMD-SF水凝膠能有效減少急性損傷的胃組織的細胞凋亡，有著良好的預防損傷作用。

現已證實，胃腸黏膜在化學物質、缺血或細胞能量不足等情況下會產生大量的氧自由基。氧自由基在整體水平和細胞水平都可以引起胃黏膜或黏膜細胞的脂質過氧化，導致胃黏膜血流障礙，引發胃黏膜損傷[18]。MDA是脂質過氧化物，可引起蛋白質變性和交聯，損害細胞及細胞膜，反映了體內脂質過氧化的程度，并間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重性，進而反映細胞損傷的程度[9]。SOD是存在于生物體內的一種抗氧化酶，能降低酒精引起的胃黏膜損傷，對酒精性胃潰瘍起到了一定的保護作用[19-20]。CMD-SF水凝膠能有效降低血中和胃組織中MDA水平和提高SOD水平，從而緩解了氧化應激反應，防止胃潰瘍的發生。

綜上，CMD-SF水凝膠能有效預防酒精引起的急性胃潰瘍的發生，可作為一種理想的預防胃潰瘍的載藥體系，主要是它能有效地黏附在胃黏膜表面，延長CMD的作用時間，從而增強其預防治療胃潰瘍的作用。