miR-105-3p在多囊卵巢綜合征患者中的表達及對人卵巢顆粒細胞增殖凋亡的影響

王芳 余柯達 楊麗華 何健英 毛佳婷 鄒立波

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種與女性激素代謝失調有關的疾病，在世界范圍內育齡婦女中發病率約5%～10%［1］。PCOS患者通常表現為無排卵、高雄激素水平、月經不調，閉經及痤瘡等癥狀，而這些癥狀促使PCOS成為不孕癥的主要原因之一［2］。PCOS還與胰島素抵抗、肥胖及血脂異常密切相關，并增加2型糖尿病和心血管疾病的患病風險。據報道，遺傳背景、環境因素、慢性炎癥及氧化應激均與PCOS的發生有關［3］。研究表明，PCOS中顆粒細胞（GCs）的失調可能是卵泡發生異常和雄激素產生過量的原因之一［4］。因此，探索GCs細胞潛在的發病機制具有臨床意義。MicroRNAs（miRs）是一類由內源基因組序列編碼的非編碼RNA分子，miRs參與較多疾?。ò≒COS）的病理進展過程，因此有望成為PCOS診斷新的生物標志物和治療靶點［5］。本研究比較PCOS患者和同齡健康女性外周血中miR-105-3p的表達水平，并通過轉染人卵巢顆粒細胞（KGN）細胞，觀察過表達miR-105-3p對KGN細胞增殖凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年10月至2019年9月本院生殖醫學中心就診的PCOS患者30例，PCOS的診斷基于2003年修訂的鹿特丹歐洲人類生殖與胚胎學會/美國生殖醫學學會標準。同時，收集同齡健康女性30例作為對照組。記錄臨床信息和生化結果。本項目經本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）qRT-PCR：采用Trizol法提取外周血中總RNA，逆轉錄成cDNA后進行 qRT-PCR。MiR-105-3p上游引物：5'-TGTGCATCGTGGTCAAATGCTCAGA-3'，下游引物：5'-TAGACACCGTAGCACATGCTCAAAC-3'；以U6核內小RNA作為內參基因，U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。（2）KGN細胞體外轉染、細胞增殖和凋亡試驗：采用lipofectamine 2000轉染試劑轉染miR-105-3p mimics和mimics negative，轉染48h后消化各組KGN細胞，并用qRT-PCR測定miR-105-3p的表達變化。細胞增殖試驗采用MTT比色法觀察細胞增殖情況，于轉染24h、48h、72h和96h測定在480nm波長處的吸光度。細胞凋亡試驗采用酶聯免疫吸附測定轉染48h的細胞凋亡情況，檢測在450nm波長處的吸光度。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件。qRTPCR數據采用7500 Software v2.0軟件對結果進行分析，2-△△Ct法計算基因相對表達量。計量資料以（±s）表示。兩組比較用雙尾獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料及生化指標 PCOS組與對照組的平均年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。與對照組比較，PCOS組體質量指數、黃體生成素、雌二醇、催乳素、總睪酮及游離睪酮含量、卵巢體積和卵巢濾泡數均較高（P＜0.05），而卵泡刺激素含量和每年月經次數則較低（P＜0.05），見表1。

表1 臨床資料及生化指標比較（±s）

表1 臨床資料及生化指標比較（±s）

項目 PCOS組（n=30） 對照組（n=30） P值年齡（歲） 26.43±3.09 25.17±4.10 ＞0.05體質量指數（kg/m2） 22.57±3.80 20.22±3.49 ＜0.05卵泡刺激素（IU/L） 5.31±1.02 6.92±1.38 ＜0.05黃體生成素（IU/L） 10.79±3.50 7.32±2.77 ＜0.05雌二醇（ng/L） 83.10±13.22 35.08±9.91 ＜0.05催乳素（μg/L） 27.95±7.38 13.84±5.21 ＜0.05總睪酮（μg/L） 1.12±0.02 0.48± 0.09 ＜0.05游離睪酮含量（ng/L） 19.60± 4.83 5.32±1.51 ＜0.05卵巢體積（cm3） 10.05±3.24 6.18±1.50 ＜0.05卵巢濾泡數（個） 15.82±4.29 4.30±1.48 ＜0.05每年月經數（次） 5.73±1.72 9.41±2.06 ＜0.05

2.2 miR-105-3p相對表達量 PCOS組外周血中miR-105-3p的表達量為（0.29±0.15），而對照組為（1.0±0.31），miR-105-3p在PCOS患者外周血中的表達量顯著低于對照組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 兩組外周血中miR-105-3p表達比較

2.3 KGN細胞轉染效率 采用熒光顯微鏡觀察KGN細胞轉染miR-105-3p mimics和mimics negative的轉染效率，miR-105-3p mimics和mimics陰性對照轉染成功的細胞顯示大量綠色熒光，而空白對照組細胞未見綠色熒光。再采用qRT-PCR分析KGN細胞中miR-105-3p的表達變化（見圖2），結果顯示KGN細胞轉染48h后，miR-105-3p mimics轉染的細胞中miR-105-3p的表達量幾乎為mimics陰性對照的16倍（P＜0.05）。

圖2 KGN細胞轉染后miR-105-3p的表達量改變

2.4 過表達miR-105-3p對KGN細胞增殖和凋亡的影響 MTT比色法顯示（見圖3A），KGN細胞轉染mimics negative 24h、48h、72h和96h后細胞在480nm處的吸光度分別為（0.41±0.03）、（0.53±0.05）、（0.72±0.06）及（0.98±0.10），而miR-105-3p mimics后細胞吸光度僅為（0.33±0.04）、（0.45±0.06）、（0.60±0.05）及（0.87±0.07）。在4個時間點miR-105-3p mimics的吸光度均顯著低于mimics陰性對照（P＜0.05）。酶聯免疫吸附測定顯示KGN細胞轉染48h后，miR-105-3p mimics的Caspase-3、Bax濃 度為（4.17±0.62）、（9.03±1.38）pg/ml，高于mimics陰性對照（P＜0.05），而miR-105-3p mimics的Bcl-2僅為（2.70±0.64）pg/ml，顯著低于mimics陰性對照（P＜0.05），見圖3B。

圖3 過表達miR-105-3p對KGN細胞增殖（A）和凋亡（B）的影響

3 討論

PCOS是一種常見的生殖障礙，異常卵泡發生被認為是PCOS最重要的病理特征。眾所周知，GCs細胞在卵母細胞發育過程中起十分關鍵的作用，目前研究已經證明GCs細胞凋亡與PCOS的發生和發展密切相關［6］。因此，探究GCs凋亡的機制對臨床PCOS的防治具有重要價值。MiRs是一類長度為21～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA序列，并且通過影響mRNA的穩定性或翻譯過程在轉錄后水平負調節基因表達。近年來，有關PCOS與miRs表達異常的研究已有文獻報道。Roth等［7］通過對卵泡液微陣列分析顯示235個miRs在PCOS患者和正常女性中呈現差異表達，其中miR-32、miR-34c、miR-135a、miR-18b和miR-9在PCOS患者卵泡液中顯著高于正常女性卵泡液。Long等［8］發現PCOS患者外周血中miR-222，miR-146a和miR-30c的表達水平較正常對照組女性外周血顯著增加。Murri等［9］研究發現，與體型較瘦PCOS患者相比，肥胖PCOS患者外周血中miR-21、miR-27b、miR-103和miRNA-155的表達水平均顯著增加。上述結果表明miRs在PCOS中呈現異常表達，并與PCOS病理過程密切相關。

研究發現，miR-105在多種腫瘤中呈現異常表達，并發揮抑癌或者促癌作用［10-11］。miR-105-3p屬于miR-105的成熟體之一，根據之前的深度測序報道，miR-105-3p在PCOS患者中的表達顯著低于健康對照組女性，提示該miR可能在PCOS發生和發展中起重要作用。本研究結果顯示，PCOS患者體質量指數、黃體生成素、雌二醇、催乳素、總睪酮及游離睪酮含量、卵巢體積和卵巢濾泡數均較健康女性高（P＜0.05），而卵泡刺激素含量和每年月經次數較健康女性低（P＜0.05），表明PCOS患者類固醇激素含量及月經明顯異常。同時，miR-105-3p在PCOS患者外周血中的表達量顯著低于對照組（P＜0.05），該結果與Xue等［12］報道結果完全一致，表明miR-105-3p在PCOS中呈現明顯低表達狀態。

在卵巢卵泡發育過程中，＞99%的卵泡發生退行性閉鎖，僅少數卵泡能夠排卵，已經證明GCs細胞的凋亡與卵泡閉鎖有關［6］。近年來，越來越多的證據表明，miRs參與卵巢GCs細胞的增殖、分化和凋亡［13］。本研究MTT比色法顯示，轉染miR-105-3p mimics的KGN細胞在四個時間點的吸光度均顯著小于mimics陰性對照（P＜0.05），表明過表達miR-105-3p mimics可顯著抑制KGN細胞增殖。細胞凋亡試驗結果表明，轉染miR-105-3p mimics KGN細胞的Caspase-3和Bax的濃度顯著高于mimics 陰性對照（P＜0.05），Bcl-2反之，提示過表達miR-105-3p mimics可顯著促進KGN細胞凋亡。表明低表達miR-105-3p主要通過抑制GCs細胞增殖并促進凋亡進而調控PCOS的病理過程。

綜上所述，miR-105-3p在PCOS患者外周血中表達下調，體外過表達miR-105-3p可顯著抑制KGN細胞生長并促進凋亡，提示miR-105-3p與PCOS病理過程密切相關，并可能作為PCOS診治的新的候選物標志物。本研究的下一步計劃將篩選miR-105-3p的下游靶基因，并闡明其對靶基因的調控作用。