液體活檢在胃癌診斷中的研究進展

米瀾，賀曉花，牟永平

(1.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特；2.內蒙古醫科大學附屬人民醫院，內蒙古 呼和浩特)

0 引言

胃癌是一種在我國的發病率和死亡率均處于前十的惡性腫瘤。胃癌的早期診斷對胃癌的診治以及預后起著至關重要的作用[1]。早期的胃癌診斷以影像學及病理活檢為主，影像學的成像技術存在不能用于實時監測腫瘤以及處于輻射暴漏的環境等問題，病理活檢則是一種“侵入性”的診斷方法。相比之下，液體活檢越來越被認為是胃癌診斷、治療及實時監測的一種檢查手段，其“非侵入式”的檢測手段在一定程度上可以替代“侵入性”的傳統實體活檢。盡管有多的優點，但也存在著一定的局限性或分析困難等問題。本文就液體活檢在胃癌診斷中應用的優勢以及某些局限性進行簡單闡述。

1 實體活檢對胃癌的診斷的分析

1.1 “實體活檢”概括

相關研究，[2-3]“實體活檢”是指利用腔鏡或者手術等方法從患者的病變處采取病變組織，最常使用的則是胃鏡取材。首先將胃鏡插入患者的胃內，通過胃鏡觀察到病變后，用活檢鉗從病變處夾取小塊組織，然后將病變組織被送到病理科，經過固定、脫水、?蠟、包埋、切片、染色等一系列步驟后制成了可以觀察的切片，由病理醫生在顯微鏡下進行診斷。判斷病變性質。

1.2 “實體活檢”的優勢

目前病理檢查在所有檢查方法中準確率最高，被譽為診斷的“金標準”[4]。因此，胃活檢，作為一種依靠病理檢查的診斷手段，對于胃病的診斷具有很高的準確性和權威性[5]。對其病變組織進行進一步的分析，有利于胃癌及時、準確的診斷。胃癌的分型種類繁多，絕大多數都可以通過“實體活檢”的方法檢測并區分。

1.3 “實體活檢”局限性

“實體活檢”是一種創傷性的檢查，雖然現在普及了無痛的腔鏡技術，但仍然會對患者消化系統粘膜造成一些創傷，在一些重癥和老年患者中，腔鏡取樣仍是一種有創傷的檢測手段。

2 “液體活檢”與“精準醫療”

1914 年，德國病理學家西奧多·博韋里 (Theodor Boveri)提出癌癥發生與遺傳有關，認為染色體異常是癌癥發生重要原因[6]。2015 年，美國總統奧巴馬 “精準醫學”的計劃，他把癌癥列為“精準醫學”中的重中之重，希望通過“精準醫學”計劃來使我們接近治愈癌癥。精準醫療和個性化醫療是基于生物標志物的發展[7]。

3 “液體活檢”在胃癌中的診斷分析

3.1 “液體活檢”概括

19 世紀60 年代，托馬斯·阿什沃思在用顯微鏡進行研究時發現了CTCs 存在于我們的外周血中。自此，腫瘤細胞可以穿透血管壁進入血液的理論進入了大眾的視野[8]?！耙后w活檢”指通過分析體液成分，來判斷腫瘤的特性，包括基因突變情況，是一種能夠檢測出攜帶腫瘤的發展和進展信息的生物標志物[9]。液體活檢包括循環腫瘤細胞(Circulating tumor cell，CTC)、 游 離DNA (Cell-free DNA， cfDNA)，、循 環 腫 瘤DNA(circulating tumor DNA， ctDNA)、外 泌 體(exosome)，、腫瘤血小板(tumor educated platelets， TEPs)等。他可以為腫瘤的早期診斷，病情發展以及治療療效提供一個信息，采用一個非侵入式的方法對腫瘤提供一個實時監測。除了完整的腫瘤細胞外，這些細胞的遺傳物質也存在于血液循環，以下將針對上文提到的“液體活檢”對胃癌診斷的研究進展進行簡要地闡述。

3.2 循環腫瘤細胞(Circulating tumor cell,CTC)對胃癌的診斷分析

3.2.1 循環腫瘤細胞(Circulating tumor cell,CTC)概述

1869 年，澳大利亞的Ashworth 首次發現CTC 存在于血液循環中，CTC 中極少數的細胞能夠在循環系統中存活下來并相互聚集，這就形成了循環腫瘤微栓子(circulating tumor microemboli，CTM)，其可以發展成轉移灶，這就造成了一些原發病還未有明顯侵襲的情況下就發生了遠處轉移[10]。部分CTC 可以發生上皮- 間質轉化(epithelial mesen- chymal transition，EMT)，這是腫瘤轉移的一個重要驅動因素[11]。

CTC 在血液中的含量極微，因此很難估計在幾百萬個正常細胞中存在單獨的腫瘤細胞，人們現在尋找一種技術，以實現最大限度的CTC 富集，然后通過相應技術來檢測血中的CTC 含量[12-13]。其中富集CTC 的方法包括陰性捕獲法和陽性捕獲法，檢測方法包括流式細胞檢測技術、反轉錄聚合酶鏈式反應 (reverse transcription -polymerase chain reaction，RTPCR)等[14]，單一的檢測方法仍缺乏一致性，因此現在推崇幾種方法的聯合檢測。CTC 芯片檢測技術是一種高效且精密度和靈敏度均高于傳統方法的檢測方式，通過基因測序的技術，胃腫瘤的診治提供了精確的信息。

3.2.2 循環腫瘤細胞(Circulating tumor cell,CTC)在胃癌中的臨床研究

喬維洲等人[15]利用CellSearch 系統通過檢測胃癌患者外周血中的CTC 含量，研究發現，在胃癌患者術后的24h 內CTC 含量呈下降的趨勢；對于Ⅳ期的胃癌患者經過一個療程的化療后CTC 含量呈明顯的下降趨勢；在發生遠處轉移的胃癌患者中，CTC 陽性患者相較于CTC 陰性的患者預后差。研究表明CTC 的含量與胃癌的復發、轉移及治療效果均有相關性。

Cheng 和Abdallah Emne A 等[16-17]使 用CanPatrol 進 行了CTC 的分離、分類和臨床分析，研究發現，上皮細胞CTC 亞群的計數及其在總CTC 庫中的相對豐度與臨床療效高度相關。CTC 程序性細胞死亡配體1 (PD-L1)可以成功用于免疫治療。研究表明與傳統方法相比，監測CTC 亞型對疾病狀態具有較高的敏感性，它在監測預后和指導未來的個體化免疫治療方面具有潛在的臨床應用價值。

房玉霞等[18]將胃癌患者分為對照組(利用腫瘤標志物對胃癌進行診斷)和研究組(利用CTC 含量對胃癌患者進行診斷)，來比較兩種方法對胃癌的診斷率。研究表明，研究組診斷的靈敏性和特異性均高于對照組，這就提示了通過CTC 檢測胃癌發病具有較高的準確率，縮短檢測時間，對胃癌的診斷具有重要意義。

3.2.3 循環腫瘤細胞(Circulating tumor cell,CTC)對胃癌檢測的優勢和局限性

循環腫瘤細胞的我們通?？梢栽谘褐袡z測，是一種無創的檢測方式，能夠免除胃鏡活檢對患者造成的痛苦和傷害，有助于對胃癌腫瘤發展的實時監測，有助于于胃癌腫瘤轉移患者的診斷、監測術后患者以及腫瘤的復發與轉移、評估抗胃癌藥物的敏感性與患者預后以及選擇個體化治療的策略[19]。在動物模型中，原位癌階段就已經檢測出了CTC 的存在，因此CTC 可能成為一個早期癌癥診斷的有用工具[20]。

循環腫瘤細胞的檢測和分析比較困難，在幾百個白細胞中只存在單個數量的循環腫瘤細胞，目前的研究主要集中在尋找循環腫瘤細胞的特異性標志物并提高檢測手段的敏感性和特異性[21]。

3.3 游離DNA (Cell-free DNA, cfDNA),和循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)對胃癌診斷的分析

3.3.1 游離DNA (Cell-free DNA, cfDNA),和循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)概述

1977 年ctDNA 首次被發現，近些年由于分子生物學和基因測序的發展，使其得到了更為廣泛的關注[22]。cfDNA 是細胞釋放到血液中的DNA 片段，ctDNA 是腫瘤細胞釋放到血液中的cfDNA。ctDNA 既可以是單鏈，也可以是雙鏈，存在于血清和血漿中，cfDNA 的來源已知的有三種：①腫瘤細胞②循環腫瘤細胞③調網或壞死的腫瘤細胞[23]。在健康個體中，凋亡細胞和cfDNA 幾乎完全清除，cfDNA 水平非常低，而在惡性腫瘤、慢性炎癥和細胞過度死亡的情況下，cfDNA 將會大片堆積。通常，我們收集全血之后離心去除細胞，然后使用試劑盒將ctDNA 提取出來，在檢測過程中最具有挑戰性是確定cfDNA 在癌癥中的特異性變異，目前先進的DNA 檢測技術已經發展起來，變異的ctDNA 檢測主要依靠PCR 和下一代測序(NGS)技術為主，NGS 提供了個性化癌癥基因特征并有助于發展個性化醫療[24-25]。

3.3.2 循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)在胃癌中的臨床研究

Kim 等人[26]采用腫瘤特異性重排的方法監測胃癌患者術后血液中的ctDNA，采用全基因組測序(WGS)的方法分析25 例胃癌的個體化癌癥特異性重組，并在術后12 個月進行ctDNA 監測，發現在19 個樣本中出現ctDNA 的存在，在檢測到ctDNA 陽性到胃癌復發的時間平均為4.05 個月，研究發現術后ctDNA 的存在與術后12 個月內胃癌的復發呈顯著相關，提示術后ctDNA 監測對胃癌患者腫瘤復發的臨床意義。

Normando Sávia Raquel Costa 等 人[27]做 了 一 項 分 析關于ctDNA 在進展期胃癌患者中的潛在作用。以每3 個月為時間單位，從每位患者身上獲取樣本(10 毫升總血液)，并同時進行CT 檢查，直到疾病進展或死亡，測定總游離DNA(cfDNA)，根據ALU DNA 序列的表達率和總游離DNA 濃度計算ctDNA 水平，結果表明晚期胃癌患者的cfDNA 濃度明顯高于正常對照組，在胃癌患者接受一個周期(3 個月)的化療后，ctDNA 降低的患者其無病生存期(DFS)的時間遠遠高于高水平ctDNA 的患者，所得出的結論是ctDNA 可能是一種特異性、非侵入性和經濟有效的新生物標志物。

Gao 等人[28]評估了30 例晚期胃癌患者的ctDNA 和原發腫瘤的突變譜，然后通過5 例患者的多次活檢對腫瘤突變進行了綜合分析，最后分析了70 例患者的ctDNA 和腫瘤配對組織中HER2 擴增的一致性。與單個腫瘤樣本相比，ctDNA的突變譜一致性較低，在配對的組織樣本中僅發現約50%的體細胞突變，但與多個活檢相比，ctDNA 的大多數突變也出現在配對的腫瘤組織中。ctDNA 與腫瘤組織的HER2 擴增高度一致，可能是一種替代組織擴增的方法。提示基于ctdna 的評估可以部分克服腫瘤異質性，可能成為胃癌HER2 分析的潛在替代方法。

3.3.3 循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)對胃癌檢測的優勢和局限性

以往研究顯示[29]，ctDNA 是胃癌早期診斷和檢測治療療效的良好指標，早起的胃癌癥狀不明顯，影像學檢查難以發現病灶，胃鏡是一個有創傷性的檢查，不是應用于所有的人群，ctDNA 檢驗克服了兩種檢查的不足之處，對胃癌診斷提到一個輔助的作用，并且可以反映腫瘤組織中的基因突變，闡明異質基因的突變特變，提高癌癥診斷的特異性。

ctDNA 的檢測技術敏感性仍需要提高，這是當前檢測的一個困難，并且檢測ctDNA 的方法并沒有達到標準化，檢測的成本比較昂貴等問題[30]。

3.4 外泌體(exosome)對胃癌診斷的分析

3.4.1 外泌體(exosome)概述

1983 年，外泌體在綿羊網織紅細胞中被首次發現[31]，他是一種小的(30-140nm) 膜結合顆粒，起源于大的多泡體(MVBs)通過融合釋放到細胞外環境，在多種疾病中它們是一種很有前途的生物標志物[32]。在多種疾病中外泌體也可大量釋放生物體液，如血漿、尿液、唾液、腹水和支氣管肺泡灌洗液。許多細胞類型都可以釋放外泌體釋，如上皮細胞、造血細胞、神經元細胞、成纖維細胞、脂肪細胞等和腫瘤細胞[33]。循環的miRNA 在一些惡性疾病中的變化具有信息性，但miRNA 易降解，所以循環中的miRNA 會被打包成各種囊泡，外泌體就是其中的一種，其對腫瘤具有調控性。理想的外泌體分離可以分離出大量的純化外泌體，對研究和檢測有重要的意義，如外泌體中的蛋白質、DNA 和miRNA 的分析[34]。傳統的外泌體分離方法是基于一系列的離心步驟排除細胞和細胞碎片，這種方法是目前最經濟的方法，但比較耗時。Urbanelli 等人[35]總結了其他一些外泌體的分離方法.是利用超濾和層析的方法進行分離，然后用聚合物沉淀的方法進行純化。每種方法都有優缺點。與CTCs 和cfDNA 相比，使用腫瘤外泌體作為預后、治療指導的生物標志物主要依賴于它的蛋白質和miRNA 的表達譜。外泌體介導的生物活性長鏈非編碼RNA 作為一種新型的非侵襲性的腫瘤診斷生物標志物，正受到越來越多的關注。

3.4.2 外泌體(exosome)在胃癌中的臨床研究

Ohzawa Hideyuki 等人[36]提取了胃癌腹膜轉移患者的腹膜液并進行了分離，分別從宏觀和微觀的角度進行了miRNA的表達分析。實驗發現，12 胃癌腹膜轉移的樣本中有4 個miRNA(miR-21-5p、miR-92a-3p、miR-223-3p、miR-342-3p)顯著上調，其表達水平與腹膜癌指數呈正相關。而miR-29 家族均下調。，在24 例胃癌腹膜轉移患者，在胃切除術miR-29 表達量往往低于腹膜轉移復發患者的miR-29b-3p表達量(P=.012)。實驗表明，在腹膜液miRNA 的表達模式反映了腹腔腫瘤負荷，可能是一個有用的生物標志物的治療點。

Cai 等人[37]對29 例健康人與63 例胃癌患者血清外泌體中Lnc RNA PCSK2-2:1 的表達進行了分析，利用受體工作特性曲線評價Exo-Lnc RNA PCSK2-2:1 作為胃癌輔助診斷標記物的臨床價值。結果表示，與健康對照組相比，胃癌患者血清外泌體中Lnc RNA PCSK2-2:1 表達水平顯著下調(P=0.006)。Exo-Lnc RNA PCSK2-2:1 的表達水平與腫瘤大小(P=0.0441)、腫瘤分期(P=0.0061)、靜脈侵犯(P=0.0367)相關。Exo-Lnc RNA PCSK2-2:1 曲線下面積為0.896。其診斷的敏感性和特異性分別為84%和86.5%。數據表明，Exo-Lnc RNA PCSK2-2:1 可能在胃癌的發展中起著極其重要的作用，可以作為一個潛在的標記用于胃癌的診斷。

Soeda Naruyoshi 等人[38]探討了外泌體包裹的miRNAs(ex-miRNAs)作為微創性生物標志物在接受治療性手術的胃癌患者中的有效性。通過比較TNM II 期胃癌患者中腹膜復發(n=3)和術后未復發(n=3)的患者以及3 名健康志愿者的miRNA 芯片數據，選擇了具有復發特異性的ex-miRNA，為外泌體包裹miRNA-21 (ex-miR-21)和外泌體miR-92a (exmiR-92a)。利用另外129 例II 期和III 期GC 患者的血漿外泌體樣本，研究了ex-miR-21 和ex-miR-92a 作為生物標志物的潛在價值。實驗結果表明，與健康對照組相比，GC 患者樣本中的Ex-miR-21 水平顯著升高，而ex-miR-92a 水平顯著降低。高miR-21 水平的II 期和III 期患者的總生存(OS)和腹膜無復發生存(PRFS)較低miR-21 水平的患者更差。低ex- 92a 水平的II 期和III 期患者的OS 和PRFS 明顯差于高ex- 92a 水平的患者。Cox 多因素分析顯示，ex-miR-21和ex-miR-92a 是II 期和III 期胃癌OS 和PRFS 的獨立預后因素。miR-21 和程序性細胞死亡蛋白4 mRNA 表達水平與miR-92a 和前列腺素E 受體4 mRNA 表達水平呈負相關。因此，ex-miR-21 和ex-miR-92a 可能作為預測II/III 期胃癌患者腹膜復發和預后的有效的微創性生物標志物。

3.4.3 外泌體(exosome)對胃癌檢測的優勢及局限性

外泌體通過協助篩選特異性基因來對胃癌患者起到一個早期診斷，早期治療以及疾病進程的檢測有很重要的意義，其結構因為有囊泡的存在，所以能夠使遺傳物質穩定的存在其研究前景十分可觀。對于發現腫瘤治療的新靶點，可能具有重要的意義，有待于進一步的研究[39]。

當今的技術對于外泌體的分離和提取仍需要進一步的標準化，這也是外泌體研究的瓶頸所在。

3.5 腫瘤血小板(tumor educated platelets, TEPs)對胃癌診斷的分析

3.5.1 腫瘤血小板(tumor educated platelets, TEPs)概述

2015 年，TEPs 由Best 新提出的一個概念[40]。血小板中含有豐富的RNA，在癌癥的發生發展過程中，腫瘤細胞可以通過不同的途徑影響血小板，從而影響到血小板中的RNA 和蛋白質，使其形成腫瘤相關血小板，腫瘤細胞能夠使血小板中的RNA 發生特異性的剪接，從而形成的獨特的miRNA 表達譜，有利于胃癌的診斷，在未來有可能會成為胃癌的檢測標志物[41]。提取方式首先要從全血中利用差速離心分離血小板，提取RNA，然后進行RNA 的擴增和測序。

3.5.2 腫瘤血小板(tumor educated platelets, TEPs)對胃癌檢測的優勢和局限性

TEPs 較替他液體活檢相比，血小板的數量多，利于提取，在未來胃癌的診治以及治療檢測中可能起著重要的作用[41]。TEPs 是近幾年新興的一種研究方向，靈床關于此類的報道較少，在臨床的應用也甚少，其技術有待發展。

4 小結

液體活檢在精準醫療領域中扮演著十分重要的角色，因為它代表了一種無創性的癌癥治療策略，可以根據個人的特點實現個性化的診斷和治療。與常規影像學檢查及實體活檢相比，液體活檢更敏感和準確，并提供了大量更多關于預后和治療方向的信息。這篇綜述了四種液體活檢方法的優缺點以及最新臨床研究進展，其主要的問題是缺乏標準和方便的技術，這也是當今液體活檢用于胃癌發展領域的一項挑戰。最后，雖然很多研究已被實施液體活檢具有臨床效用，但大多數是回顧性的研究，因此，需要更嚴格的研究來驗證液體活檢的巨大潛力。