防御素對腸道炎癥反應和微生物的調節機制

■顏文新 劉 剛，2 方 俊*

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙410128；2.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，湖南長沙410125）

由于仔豬的腸道尚未發育健全，易受病原微生物、外來抗原和其他有毒有害分子的侵襲，導致腸道屏障功能受損，菌群失調，細菌與內毒素移位，產生炎性反應[1-2]。這種炎性反應又會進一步損傷腸黏膜，增加腸通透性，促使細菌移位，而形成惡性循環，導致全身炎癥反應，使得豬處于亞健康狀態，降低了動物對營養物質的利用率，還降低了生產效率[3]。

防御素是先天免疫的主要效應物，在宿主免疫系統中起著重要的作用，其重要性已被廣泛認可[4-5]。潘氏細胞(Paneth cell)系的腸上皮細胞能產生并分泌的抗菌肽——α防御素，使得細胞可以感受以細菌、膽堿以及其他外界刺激，進而通過去除病原體并與有益微生物共生，保持腸道穩態平衡[6-7]。防御素對細菌有選擇性的抑菌活性，可以有效地殺死致病細菌，但對某些共生細菌的抑菌活性很小，對某些共生細菌無抑菌活性[8-9]。多個研究顯示防御素對腸道微生物群組成具有調節作用，腸道炎癥狀態下的腸道抗菌肽，特別是防御素在回腸和結腸中表達紊亂，從而影響了整個腸道的穩態[10-11]。因此，防御素可能作為連接微生物和疾病的一種機制起著關鍵作用，本文綜述了防御素在仔豬腸道炎癥反應中的作用，并對防御素調控仔豬腸道炎性反應的機制進行了討論。

1 腸道中的微生物及菌群失衡

腸道吸收了生命所必需的營養成分，腸上皮細胞直接與食物和微生物接觸，處于不斷的刺激之下，因而他們在營養吸收和黏膜免疫等方面發揮著重要作用[12-13]。腸道中的微生物大約有1×1014個，正常腸道菌群由數量龐大的共生的微生物組成[14-15]。近年來，人們發現腸道微生物區系與各種疾病之間的相關關系。其重要原因之一是由于宏基因組分析技術的快速發展，這種分析技術對不可培養的微生物也能夠有效的定量和檢測[16]。同時，抗菌肽及防御素在調節微生物群作為先天免疫主要效應物的重要性也得到了廣泛的認可[10-11，17]。潘氏細胞響應某些刺激從而表達α-防御素，α-防御素不僅直接參與除去病原體，而且有助于維持正常腸道菌群建立穩態[10，18]。

腸道微生物是免疫系統的關鍵調節劑。腸道微生物在不同的效應和記憶T 細胞群體的分化中起作用，這是產生IL-17 等促炎因子和IL-10 等抗炎因子所必需[19]。目前已有許多研究報道了腸道炎癥中微生物菌群失調，例如共生細菌多樣性減少和黏膜相關細菌數量增多與腸道炎癥發展相關[20]。宏基因組學研究也顯示了腸道炎癥中微生物與對照組微生物區系的差異，目前認為：①腸道炎癥中幾種硬壁菌門和擬桿菌門的數量減少。在擬桿菌中，脆弱擬桿菌（B.fragilis）在誘導結腸炎的小鼠模型中顯示出重要的保護作用[21]。此外，在厚壁菌類中，普氏糞桿菌（F.prausnitzii）數量減少[22]。在腸道炎癥的小鼠模型中，口服普氏糞桿菌可以降低炎癥反應，并有助于恢復正常的微生物組成[22]。因此，脆弱擬桿菌和普氏糞桿菌的豐度下降可能導致腸道的炎癥狀態；②腸道炎癥中變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）水平增加，特別是黏附侵襲性大腸桿菌的數量較高[23-24]。研究已經證明侵襲性大腸桿菌可以入侵巨噬細胞，在細胞內復制，并刺激產生大量腫瘤壞死因子（TNF-α）等促炎因子；③腸道炎癥中穿透黏液層的細菌數量增加[25-26]。在腸道炎癥的腸上皮細胞中經?？梢杂^察到一些黏液溶解細菌如活潑瘤胃球菌（Ruminococcusgnavus）和扭鏈瘤胃球菌（Ruminococcus torques）[27-28]。因此，腸道炎癥期間微生物群可能與黏膜接觸更密切[29]。

2 腸道屏障與潘氏細胞及分泌的防御素

腸道屏障在腸道免疫功能中發揮著重要的作用，允許離子、水和其他營養物質透過腸道屏障，但腸道內的微生物無法通過腸道黏膜屏障。腸道由一層柱狀上皮細胞組成，為抵抗進入腸腔的微生物提供了第一道防線。這些細胞中超過80%的細胞是腸上皮細胞，而其余的則是腸分泌細胞、杯狀細胞或潘氏細胞[30]。

潘氏細胞分泌的α-防御素是小腸上皮產生和釋放的主要抗菌肽。潘氏細胞也分泌其他的抗菌肽如Reg3γ、溶菌酶和分泌型磷脂酶A2等[31]。此外，潘氏細胞是腸上皮微環境的重要組成成分，并與腸道干細胞發生相互作用[7]。潘氏細胞可以產生生長因子和Wnt 信號分子，導致Wnt 和Notch 關閉，這些物質被遞送到隱窩基柱狀細胞誘導特定上皮細胞譜系的分化。因此，潘氏細胞在腸道天然免疫和小腸上皮細胞的再生/分化中起重要作用[32-33]。然而，潘氏細胞最重要的作用是通過分泌α-防御素為腸道提供防御作用。

α-防御素不僅具有殺死病原體的功能，也可以通過維持正常腸道微生物群的組成而有助于腸道動態平衡。例如，基質金屬蛋白酶-7（matrix metalloproteinase 7，MMP7）缺陷型小鼠的回腸微生物群，由于缺乏激活了的隱窩素，與野生型小鼠相比，厚壁菌門的比例明顯升高，類桿菌比例顯著下降[34]。此外，在潘氏細胞中表達α-防御素HD5 轉基因的DEFA5+/+小鼠中，腸道中的微生物菌群組成與野生型菌株顯著不同，厚壁菌門比例下降，同時擬桿菌門比例上升[35]。在潘氏細胞分泌的六個最豐富的α-防御素中，cryptdin4 是最有效的殺微生物劑。Masuda 等發現具有三個二硫鍵的cryptdin4 顯示出對致病菌的有效殺菌活性，但對共生細菌例如雙歧桿菌、干酪乳桿菌和脆弱擬桿菌沒有抑菌活性或抑菌活性很低[10]。相反，沒有二硫鍵的cryptdin4 則殺死致病細菌和共生細菌。這些結果表明，潘氏細胞分泌的α-防御素具有二硫鍵依賴性的殺菌活性，并在通過調節腸道微生物的組成來維持腸道環境中發揮作用。

3 炎癥狀態下潘氏細胞被破壞，打破腸道穩態

盡管我們對仔豬腸道炎癥發病機制的認識還不全面，但目前的研究已經揭示出了許多炎癥的風險因子及一些與病原相關分子模式，自噬和內質網應激反應的識別受體有關，這些分子還多都有在潘氏細胞中表達。此外，遺傳缺陷NOD2、自噬和內質網應激基因影響潘氏細胞選擇性，可能會影響腸道炎癥的發病機制[36]。在具有自噬基因Atg16L1 缺陷的小鼠中，潘氏細胞出現形態學異常并且伴有分泌缺陷[37]。研究指出突變的Atg16L1 及諾如病毒特異性菌株的感染導致潘氏細胞的破壞[38]。此外，敲除Xbp1 基因導致蛋白無法正確折疊，誘導出小鼠潘氏細胞凋亡，進而導致嚴重的回腸炎[39]。此外，在缺失前梯度2 基因（Anterior Gradient 2）的結腸炎小鼠中發現了無法分泌粘蛋白2 的杯狀細胞，同時由于內質網應激導致了潘氏細胞形態改變[40-41]。這些結果表明導致潘氏細胞穩態破壞的遺傳缺陷可通過減少α-防御素的產生和分泌而削弱腸道的先天免疫。

4 結論

從潘氏細胞及其分泌的α-防御素的作用最近研究進展來看，防御素對于穩定腸道微生物群的組成非常重要。他們通過防止細菌過度生長和抵抗潛在的致病細菌侵入上皮從而促進了腸道的正常功能。防御素表達的改變對微生物群具有負面影響并且可以引起炎癥狀態。防御素在腸道炎癥中表達的改變在腸道炎癥的發病機制中可能起重要作用，特別是回腸炎癥與潘氏細胞分泌的防御素的缺乏有關?；謴头烙氐恼１磉_可重新平衡腸道微生物群并改善腸道炎癥。綜上所述，防御素可通過調控腸道微生物從而成為腸道炎癥及抗炎治療潛在的新靶點。但防御素介導的炎癥反應的機制仍值得探索。