長鏈非編碼RNA在心血管疾病中的作用及機制*

李 鼎， 王大新， 梁景巖

1中南大學湘雅二醫院心血管內科，長沙 4100112江蘇省揚州大學臨床醫學院(蘇北人民醫院)心血管內科，揚州2250013江蘇省揚州大學醫學院，揚州225009

1 LncRNA概述

1.1 LncRNA的來源與結構

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類由RNA聚合酶Ⅱ轉錄而來，具有5′端甲基化帽和3′端多聚A尾，結構與mRNA相似的、核苷酸數大于200的功能性RNA分子。與mRNA相比，LncRNA缺乏完整的開放閱讀框。最近，在人類基因組中發現了19175個潛在的功能性LncRNA[1]。根據LncRNA在基因組位置、與鄰近編碼蛋白質的關系及對基因序列的影響，它們通常被分為順式、反式、雙向、基因內及基因間等5種類型。由于LncRNA具有較長的序列及復雜的三維結構，結構域復雜，因此有著能夠和包括DNA、RNA和蛋白質在內的各種大分子相互作用的多種位點，作用范圍涉及基因表觀遺傳水平、轉錄水平和轉錄后水平的調控，也可作為競爭RNA發揮“海綿”作用[2]。對心血管疾病的發生和發展有著獨特的“隱形”調節功能?？傮w而言，LncRNA一般是通過LncRNA/circRNA-miRNA-mRNA軸參與這一過程。

LncRNA多數定位在細胞核[3]，這是因為其剪接效率低、多聚腺苷化以及易被染色質上的外泌體降解。同時LncRNA所具有的靈長類特異性的短散布核元件(SINE)與核基質蛋白HNRNPK結合可促進LncRNA核保留。另外一些特殊結構的LncRNA含有與核蛋白相關的特定順式元件亦促進LncRNA在細胞核中累積。當LncRNA定位于細胞核之后，LncRNA能對核組織及其功能起到重要調節作用。

1.2 LncRNA的生物功能

LncRNA對基因表達的調節可有以下幾種方式：①信號分子，LncRNA在特定的時間表達，在特定的空間發揮作用；②誘餌分子，LncRNA引誘轉錄因子和其他蛋白質與染色質隔離，利用與mRNA互補的序列結合mRNA從而減少基因翻譯，進一步抑制轉錄表達；③引導分子，LncRNA引導轉錄因子與特定的基因啟動子區域結合，或者使用與啟動子DNA互補的序列促進靶基因激活；④骨架分子，LncRNA將2個或更多蛋白質結合組成核糖核蛋白復合體參與修飾染色質；⑤增強分子，LncRNA誘導染色體將增強子和啟動子區域結合在一起促進下游翻譯[4-6]。

2 LncRNA與血管內皮疾病

目前炎癥學說是廣為認可的與動脈粥樣硬化病理演化相關的學說，在炎癥因子刺激下，血管內皮細胞、平滑肌細胞、心肌細胞和心肌成纖維細胞共同參與一系列病理生理學改變如增殖、遷移、凋亡、纖維化、自噬和壞死。研究表明，血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的表型從收縮狀態到合成狀態的轉換促成了包括動脈粥樣硬化、粥樣斑塊穩定和血管內膜增生在內的多樣化血管病變。

一些在人冠狀動脈平滑肌細胞(human coronary artery vascular smooth muscle cells，HCASMCs)和人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)中富含的LncRNA能夠促進內皮細胞和平滑肌細胞富集、遷移、分化，LncRNA可通過調節血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFA)、缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)等因子而調節血管生成的各個過程；血小板衍生生長因子家族成員之一的VEGFA，能增強血管通透性，誘導新生血管生成，擴張血管床。在低氧條件下，HIF-1可通過與其他促血管生成因子如VEGFA或血管生成素等相互作用，參與生理性或病理性調節血管生成途徑。LncRNA也可作為內源性海綿調節基因來調節下游與血管生成有關的miRNA功能而間接調節血管生成。因此，LncRNA是抗血管生成潛在的治療靶點，其對于心血管類疾病炎癥通路的影響不可忽視。

2.1 LncRNA調節與動脈粥樣硬化密切相關的平滑肌細胞及內皮細胞功能

來源于內皮細胞的外泌體的基因間LncRNA-RNCR3具有動脈粥樣硬化保護作用，也被稱為LINC00599，在小鼠和人主動脈粥樣硬化病變中的表達顯著上調[7]。敲除RNCR3后，動脈粥樣硬化進程加快并且高膽固醇血癥加重，炎癥因子釋放增加，血管內皮細胞(endothelial cells，ECs)和血管平滑肌細胞減少增殖和遷移，細胞凋亡加速。在體外實驗中，氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，OX-LDL)在內皮細胞和血管平滑肌細胞中沉積后，LncRNA-RNCR3水平顯著升高。LncRNA-RNCR3作為競爭性內源RNA(ceRNA)，與Kruppel-like factor 2和miR-185-5p形成反饋回路，共同調節細胞功能。誘導RNCR3上調是防治動脈粥樣硬化相關血管功能障礙的有效干預策略。

通過對RNA序列數據庫分析，Ballantyne等[8]發現了位于8號染色體上，距離蛋白編碼基因HAS2 750 kb的LncRNA-SMILR，HAS2可編碼合成透明質酸(HA)酶，而透明質酸是動脈粥樣硬化病變及血管再狹窄時組成細胞外基質的關鍵成分。研究發現具有血管平滑肌細胞特異性過表達HA的轉基因小鼠對動脈粥樣硬化的易感性增加，并在袖帶損傷后形成了增強的新內膜。與未受刺激的細胞相比，受到白細胞介素1α和血小板衍生生長因子刺激的血管平滑肌細胞顯著上調表達LncRNA SMILR。對不穩定動脈粥樣硬化斑塊性病變分析發現，LncRNA SMILR水平與炎癥標志物C反應蛋白水平相關，都呈現升高趨勢，并且LncRNA-SMILR能夠特異性靶向HAS2而不影響HAS1或HAS3。因此下調SMILR水平可以特異性抑制HAS2表達調控VSMC的增殖[9]，對血管動脈粥樣硬化有保護作用。

2.2 LncRNA調節與動脈粥樣硬化有關的炎癥反應

當血管內皮細胞處于炎癥環境下時，動脈粥樣硬化進程加快。LncRNA Let-7e抑制靶基因(IκBβ)的表達來促進NF-κB的活化及向細胞核轉運，增加了炎癥因子和粘附分子的表達，促進血管內皮細胞的炎癥反應和動脈粥樣硬化的發生發展[10]。而LncRNA-MKI67IP-3充當Let-7e的競爭性內源RNA(ceRNA)，抑制其促炎作用，減輕炎癥反應。但Let-7e也能以正反饋的方式下調LncRNA-MKI67IP-3進一步加重炎癥反應。進一步揭示針對LncRNA-MKI67IP-3的干預措施可以限制動脈粥樣硬化的進展和不利的血管重塑。

LncRNA NEXN-AS1(nexilin F-actin，結合蛋白反義RNA 1)可調節肌動蛋白結合蛋白(NEXN)的表達[11]，對動脈粥樣硬化有保護作用。通過對表達芯片的分析發現，在人動脈粥樣硬化斑塊中NEXN-AS1和NEXN的表達均降低。NEXN-AS1表達的增強抑制了TLR4寡聚化和NF-κB活性，下調內皮細胞粘附分子和炎性細胞因子的表達，并抑制單核細胞粘附于內皮細胞，從而改善動脈粥樣硬化斑塊的形成。

研究發現，與ApoE-/-/MALAT1+/+對照小鼠相比，使用高脂飲食喂養的ApoE-/-/MALAT1-/-小鼠動脈粥樣斑塊體積和炎性CD45+細胞浸潤增加[12]。在人類動脈粥樣硬化中也觀察到了類似情況，并與心血管不良預后事件相關。MALAT1(肺腺癌轉移相關轉錄本1)以“海綿”的形式吸附干擾miR-503來實現抗炎并抑制動脈粥樣硬化。當MALAT1缺乏將導致髓樣細胞與血管壁的粘附增強和細胞因子產生增加，動脈粥樣硬化情況進一步惡化。在糖尿病人群中已發現miR-503損害缺血后修復性血管生成。

目前研究表明LncRNA除了參與動脈粥樣硬化病理性進程，調控平滑肌細胞、內皮細胞功能及血管周圍炎癥反應以外，也可以促進新生血管生成。

在ApoE-/-小鼠及t-BHP處理后的HUVEC的血清樣本中，LncRNA NEAT1表達增加，miR-181d-5p表達減少[13]，進一步研究發現LncRNA NEAT1通過靶向作用于miR-181d-5p/CDKN3軸降低了HUVEC凋亡及Caspase-3活性，產生促血管生成的效果。

LncRNA HOTAIR通過在轉錄水平直接調節VEGFA表達或者間接通過葡萄糖調節蛋白(GRP)78-Ang2-VEGFA軸上調合成VEGFA，進一步促進血管生成[14]。

目前隨著冠脈介入手術的不斷應用和發展，在血管重塑過程中，當血管平滑肌細胞表型從收縮狀態轉換到增殖狀態時，去分化的血管平滑肌細胞在內膜中積聚，最終導致血管動脈硬化再狹窄。而穩定的內皮功能對于維持血管生理功能，保障冠脈支架植入的長期通暢至關重要。內皮細胞能調節血管對剪應力變化的反應，支架植入后管腔內皮細胞單層的快速再生是防止支架內再狹窄和血栓形成的關鍵[15]。研究發現，LncRNA在血管成形術后再狹窄中扮演的角色同樣不可忽視。例如與正常人相比，冠心病患者的冠狀動脈組織中LncRNA-p21下降，這種下降在一定意義上加劇了血管急性損傷后的再狹窄[16]。研究人員使用一種蛋白質-RNA結合的預測方式catRAPID發現lncRNA-p21能與MDM2(mouse double minute 2)結合，減少MDM2與p300的結合，從而促進乙?；D移酶p300與p53結合，p53乙?；蠡钚栽鰪?，加快凋亡的進程。反之，敲除lncRNA-p21會抑制p53活性，并改變MDM2/p53和p300/p53復合體之間的平衡[17]，促進動脈粥樣硬化。上調LncRNA、Gas5和CIRC-ANRIL水平促進VSMC凋亡，減緩新生內膜增生(neointimal hyperplasia，NIH)[18]。

3 LncRNA與心臟病

哺乳動物早期胚胎存在3個胚層：外胚層、中胚層和內胚層。中胚層組織可再分為體節、間介、側板中胚層。肌肉、血管和成人的心臟是中胚層的主要衍生物。因為血管和心臟是同源組織，既然LncRNA可以參與調節血管動脈粥樣硬化進程，必然可以通過多種機制調節心臟發育及衰老。

3.1 LncRNA與心肌細胞凋亡、心肌梗死

當心肌細胞長時間處于缺氧、缺血狀態時，容易出現心肌梗死，并影響生存預后，LncRNA-MIAT(myocardial infarction-associated transcript，MIAT)，是心肌梗死的敏感位點，其在外周血的表達水平可以區分ST段抬高(低MIAT)和非ST段抬高性心肌梗死。同樣，Li等[19]發現LncRNA-LIPCAR在ST段抬高性心肌梗死患者中含量升高。

LncRNA ANRIL通過調節miR-7-5p/SIRT1軸對缺氧誘導損傷H9c2細胞起保護作用。ANRIL通過與miR-7-5p競爭性結合，正向調節sirtuin 1(SIRT1)的表達。SIRT1表達增加可減弱miR-7-5p水平上調對缺氧H9c2細胞的損傷影響[20]。

阿托伐他汀(ATV)預處理間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)后得到的外泌體(exosomes，Exos)能促進內皮細胞功能而顯著提高對急性心肌梗死的治療效果[21]。進一步研究發現LncRNA H19至少部分通過介導MSCATV-Exo促進血管生成達到心臟保護作用。

在使用D-半乳糖誘導的新生大鼠心肌細胞衰老模型中，LncRNA H19水平下調[22]，提示了人為造成心肌缺血后的心肌保護功能喪失。進一步研究發現在缺氧環境中，H19表達沉默后，miR-29b-3p水平相對增加，心肌細胞衰老損傷情況進一步惡化。綜上所述，LncRNA H19或許通過外泌體作用于下游miRNA通路從而保護心肌細胞。相對而言，來源于臍帶間充質干細胞(UMSC)的外泌體釋放的LncRNA MALAT1能抑制NF-κB/TNF-α信號通路，增加端粒長度，延緩衰老引起的心臟功能障礙。

主要在心肌細胞中表達的高度保守的LncRNA NR_045363在7日齡小鼠心臟中過表達可以刺激心肌梗死后心肌細胞再次增殖。特異性敲除NR_045363后抑制原代胚胎心肌細胞的增殖，LncRNA NR_045363主要通過與miR-216a相互作用，進一步調節JAK2-STAT3途徑促進心肌細胞的DNA合成和胞質分裂[23]。

3.2 LncRNA與心肌纖維化

心肌中正常心肌細胞因處于缺血、缺氧環境而減少后，成纖維細胞活化異常增殖，通過成纖維作用生成心肌細胞外基質并過度沉積，且伴隨著Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白比例升高。心肌纖維化是心室重構的主要病理表現，最終導致心肌收縮和舒張能力下降，影響心電傳導。心肌纖維化是伴隨多種心臟疾病的終末表現形式，如冠心病、高血壓、心律失常等。

研究表明，LncRNA生長特異性阻滯因子5(GAS5)表達升高時可下調miR-21的表達，miR-21在心臟纖維化組織以及活化的心臟成纖維細胞中過度表達，對心臟纖維化進展有著促進作用[24]。miR-21表達下降抑制了心肌纖維化進程。此外，在心臟成纖維細胞中，miR-21也能對GAS5產生負調控的作用。

3.3 LncRNA與心肌肥厚

生理或病理性刺激使心臟壓力或容積負荷增加，心肌細胞壞死、凋亡和纖維化，引起心肌重構進一步導致心肌肥厚。心臟肥大伴適應不良的心臟重塑是導致心力衰竭的最危險因素。研究表明，LncRNA在心臟重構調控中扮演著至關重要的角色。對心肌細胞能量代謝、心臟結構和功能的改變有著調節作用。

心肌細胞肥大時刺激LncRNA-CYTOR表達水平顯著上調[25]。研究表明，LncRNA-CYTOR能作為miR-155的ceRNA減少miR-155誘導的抑制IKBKE效應。而CYTOR基因敲除后可加重主動脈縮窄誘導的心肌肥大或AngⅡ誘導的心肌肥大。

心肌肥大相關表觀遺傳調節因子LncRNA-Chaer[26]直接與多克隆抑制復合物2(PRC2)作用，抑制參與心肌肥大的基因啟動子區的組蛋白H3-賴氨酸27甲基化，對心肌肥大有促進效果。

LncRNA Chast(心肌肥大相關轉錄本)通過抑制Pleckstrin同源性含域蛋白M家族成員1而阻止心肌細胞自噬并驅動心肌肥大發生[27]。

LncRNA-Mhrt(myosin heavy chain associated RNA transcript，肌球蛋白重鏈相關RNA轉錄本)通過與miR-145a-5p直接結合或與KLF4形成復合物抑制KLF4(Kruppel-like factor-4)磷酸化，從而促進具有調節內皮細胞和平滑肌細胞的增殖和分化作用的KLF4表達，阻止ERK與KLF4的結合，降低了肌鈣蛋白的表達，從而抑制心肌肥厚[28]。

LncRNA與心肌肥厚之間有著絲絲縷縷的相互關系，或是促進，或是阻抑，調節相關LncRNA表達對防止心肌功能進一步惡化有著重要的意義。

3.4 LncRNA與擴張性心肌病

擴張性心肌病可在任何年齡診斷，但大多數發生在30至40歲之間。擴張性心肌病是以左室、右室或雙心腔擴大和舒縮功能障礙為主要特征的復合型心肌病。

Zhang等[29]選擇816名冠心病患者和266名對照者作為研究對象，先采用基于微陣列的循環LncRNA圖譜分析篩選出待排查的LncRNA，然后采用qRT-PCR檢測病例及對照組血漿中LncRNA的表達情況，使用受試者工作特征曲線分析相關LncRNA對冠心病的鑒別診斷價值，通過Spearman相關分析研究隊列發現與左心射血分數(LVEF)、左室舒張末期直徑(LVEDD)以及血漿N末端B型利鈉肽原(NT-proBNP)心功能指標呈負相關的LncRNA ENST00000507296。當循環中LncRNA ENST00000507296水平越低，擴張型心肌病患者生存率越高。而LncRNA ENST00000532365表達水平與心功能呈正相關?；谖㈥嚵械难hLncRNA分析發現，和對照組相比，擴張性心肌病患者循環中LncRNA ENST00000507296、LncRNA ENST00000442293和LncRNA ENST00000545794含量分別增加了198%、49%和76%。另一方面，LncRNA ENST00000532365、HMl LncRNA1548分別降低了46%和40%。這些差異表達的LncRNA有可能成為新的預測擴張性心肌病的標志物以及潛在治療靶點。

當擴張型心肌病進一步惡化時，心肌細胞發生壞死、數量減少、炎癥細胞浸潤、心肌間質增生、纖維化加重等一系列病理生理改變，促成了心肌重構，最終導致心力衰竭。

3.5 LncRNA與心力衰竭

LncRNA作為新興的心血管疾病的生物標志物與心力衰竭的診斷和預后判斷密切相關。心肌梗死患者的外周血中，HIF-1α、KC-NQ1OT1、MALAT1含量增加，ANRIL含量下降，其表達變化在ST段抬高型心肌梗死與非ST段抬高型心肌梗死中也有不同。血漿LncRNA LIPCAR水平在射血分數降低心力衰竭(HF)患者中升高，并且和左心室重塑及心血管不良預后相關[30]。

在與對照組對比中發現，慢性心力衰竭患者LncRNA GASL1水平下降[31]。LncRNA GASL1表達增加時可抑制TGF-β1從而抑制心肌細胞凋亡，改善心力衰竭狀況。另外一種LncRNA CPR(cardiomyocyte proliferation regulator,心肌細胞增殖調節因子)作用于DNA methylation machinery(DNMT3A,DNA復制和細胞周期進程的啟動者)并將其募集到其啟動子半胱氨酸-磷酸-鳥嘌呤位點來抑制心肌細胞的增殖，對心臟修復具有負性調節作用[32]。Hua等[33]使用免疫組織化學和實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測發現，血漿中LncRNA COL1A1 ≥ 256.5 ng/mL和心力衰竭心臟移植術后1年內低存活率相關[HR：7.4，95%CI：3.5～15.8，Log rankP<0.01]。

過表達Lnc DACH1抑制了小鼠心尖切除術后心肌細胞再生導致的心臟功能惡化。特異性敲除LncDACH1或通過腺病毒介導沉默LncDACH1，幼年和成年小鼠心肌梗死后的心肌細胞增殖潛能被重新激活，并進一步促進心肌再生。進一步研究發現LncDACH1通過參與蛋白磷酸酶1催化亞基α(protein phosphatase 1 catalytic subunit alpha，PP1A)/yes-相關蛋白1(yes-associated protein 1，YAP1)信號通路抑制心肌細胞再生[34]。

監測血液中的LncRNA含量，敲除相關抑制再生的LncRNA無疑對心力衰竭有著積極的改善作用。

3.6 LncRNA與糖尿病心肌病及焦亡

目前發現細胞主要有3種死亡模式：程序性凋亡、自噬和壞死。之前有研究發現，LncRNA Neat1在缺血再灌注處理的糖尿病大鼠心肌組織中高表達。Neat1的過表達促進了乳酸脫氫酶、肌酸激酶和肌酸激酶-MB的產生，LncRNA Neat1通過上調Foxo1表達水平加重缺氧復氧損傷，促進心肌細胞自噬和凋亡，導致心肌梗死面積增加[35]。丁酸鈉可顯著降低7-Ket(7-酮膽固醇)或CHC(膽固醇晶體)誘導的NLRP3炎癥小體的形成和激活，進一步抑制冠狀動脈內皮細胞中半胱天冬酶-1的表達[36]。從而改善糖尿病大鼠主動脈內皮功能障礙，減輕內皮氧化應激損傷[37]

新近研究認為，焦亡同樣在心血管疾病病理性發生發展過程中扮演著重要角色。細胞焦亡本質上是細胞炎性壞死，也是一種程序性細胞死亡[38]。

糖尿病心肌病(DCM)可引起心力衰竭、心律不齊和猝死等后果。細胞焦亡參與了DCM相關病理性進展改變，GSDMD(Gasdermine D)是焦亡的執行者，也是半胱天冬酶-1(Caspase-1)作用的底物。GSDMD被Caspase-1切割成GSDMDN的N端蛋白水解片段(GSDMDN)，在細胞膜上形成孔隙，細胞不斷脹大直至膜破裂，釋放大量的促炎細胞因子如IL-1β等，進一步激活級聯的炎癥反應[39-41]。最終會影響心肌細胞線粒體更新，導致心臟能量供給失調。

LncRNA KCNQ1OT1在糖尿病患者、高糖誘導的心肌細胞模型和糖尿病小鼠心肌組織中表達增加。KCNQ1OT1通過靶向結合miR-214-3p和Caspase-1介導下游焦亡通路，與焦亡的執行者GSDMD之間可能存在著密切的聯系。此外，沉默KCNQ1OT1表達后，miR-214-3p上調，從而抑制Caspase-1表達，減少細胞死亡、細胞骨架結構異常和體外鈣超載情況，改善心臟功能[42]。

通過調節心臟相關LncRNA的表達水平，能夠為糖尿病及缺血性心肌病提供新的治療策略。

4 展望

LncRNA分子結構穩定、種類多樣，并具有很強的細胞和組織特異性以及發育階段的特異性表達[2]。隨著LncRNA與心血管疾病之間的潛在聯系不斷被發掘，LncRNA不再僅僅是以前所認為的基因垃圾。通過采用高通量測序技術及生物信息手段，不僅能在多種體液環境中檢測到LncRNA，并且LncRNA不易被降解。越來越多的研究注意到LncRNA在表觀遺傳、基因轉錄和翻譯表達水平上，通過不同的作用靶點及作用途徑參與心血管疾病的發生發展。

然而目前研究主要集中在動物模型中，采用質粒構建或者病毒轉染提高LncRNA的表達，或者使用干擾RNA技術降低LncRNA的表達[43]，通過升高或者降低LncRNA的水平來調節mRNA的表達，從而達到減少心血管損傷的目標。從動物試驗到人體試驗仍需要一段過程，LncRNA作用機制多樣，深入研究LncRNA治療方案能為未來干預基因相關性心臟疾病提供堅實的基礎。

綜上所述，LncRNA作為一種新近被發現的心血管中的生物標志物與基因治療靶點，LncRNA對心血管疾病的調控機制復雜多樣，同一LncRNA可能參與多種心血管疾病，一種心血管疾病可能由多個LncRNA及其下游通路參與調節。尋找各個疾病的確切靶位點及其調控機制仍需要大量的研究工作，隨著LncRNA及其調控靶點在心血管疾病中的作用機制不斷明確，在提示相關心血管疾病進展方面顯示出了巨大希望。LncRNA將為心血管疾病的診斷和治療提供新的理論指導及治療方向，將其應用于臨床勢必有著遠大的前景。