基于GelMA 復合水凝膠的制備及性能研究1

強 娜，廖芳麗，解 芳，馮 穎，李佳佳，馮裕發

（惠州學院 化學與材料工程學院，廣東 惠州 516007）

水凝膠是在組織工程和再生醫學中應用的生物支架.水凝膠的高含水量，可調節的化學和物理性質，以及封裝細胞、生物大分子（如肽/蛋白質、核苷酸和抗體）和治療制劑的能力，開辟了各種潛在的應用［1-2］.特別是，允許原位交聯的生物聚合物可用于開發可注射材料.由于天然或合成聚合物制成的可注射水凝膠已被廣泛報道，并顯示出其各自的優缺點［3-4］.例如，透明質酸、殼聚糖、藻酸鹽、硫酸軟骨素等天然水凝膠，因其良好的生物相容性和生物降解性而得到廣泛應用，但由于其機械性能較低，且難以調節其降解速率和生物功能，其應用受到限制［5-7］. 另一方面，左旋聚乳酸（PLLA）、聚乙二醇（PEG）和聚乙烯醇（PVA）等合成聚合物水凝膠具有較高的機械強度和可調的微觀結構，但經常缺乏一定的生物信號分子，因此，有必要開發集天然和合成聚合物的優點于一身的水凝膠［8-9］.

因此，為了同時獲得具有良好生物相容性和機械性能的水凝膠，半天然和化學功能化水凝膠（如甲基丙烯?；髂z（GelMA）出現了［10］.近年來，有報道此水凝膠與纖維支架聯合應用于軟骨［11］、心臟瓣膜［12］、肌腱［13］、肌肉［14］等軟組織的再生.早在2000 年，Van Den Bulck等人開發了一種用甲基丙烯酸酐（MA）對明膠進行改性的方法，并獲得了一種光交聯明膠衍生物，稱為甲基丙烯?；髂z（GelMA）［15］.此后，GelMA作為一種具有吸引力的生物材料被廣泛研究.多項研究表明，GelMA 水凝膠既適用于二維細胞播種，也適用于三維細胞封裝，適用于不同的制造工藝，如微成型、自組裝、微流體、生物打印、生物紡織品等.通過控制交聯的程度，可以對明膠凝膠的機械強度進行有效調節.同時由于具有甲基丙烯酸酐基團，使得制備出來的水凝膠材料具有了光敏性.另外，在這個過程中，至多只有5%的明膠序列進行了反應，這樣的結果是能夠最大程度保留了明膠自身所攜帶的明膠功能氨基酸序列，例如RGD 多肽序列、MMP 降解序列，這些序列都可以與甲基丙烯酸不發生甲基丙烯?；磻?所以，經過化學改性制備的GelMA 可以擁有良好的生物活性，可以促進細胞粘附，而且這種水凝膠材料經體內的蛋白酶就可以進行降解.

純GelMA 水凝膠是一種良好的生物降解材料，然而，當它作為某些應用時，如作為引導骨再生材料使用時：凝膠時間長、機械強度低、降解時間短、溶脹率高，限制了其應用.此類水凝膠要成為合適的組織工程支架材料，必須具有較短的凝膠化時間以減少操作時間，合適的機械強度和降解時間以保持組織重建的空間，較低的溶脹率以降低創傷壓力、避免炎癥.

在所有合成的聚合物材料中，以聚乳酸（PLA）［16］、聚羥基乙酸（PGA）［17］及聚己內酯（PCL）［18］為代表的聚α－羥基酸和它們的聚合物是組織工程領域中研究最廣泛的一類聚合物.此類高分子聚合物材料因生物相容性好、可降解且降解速度易于調控等優點，在生物材料領域占主導地位.

因此，本研究設計將PLLA 與GelMA 進行共混，通過熱量分析（TG）、差示掃描量熱法（DSC）、掃描電子顯微鏡（SEM）、X 射線衍射（XRD）來測試復合水凝膠的熱分解溫度、玻璃化轉變溫度、結晶度等.根據分析結果探究不同比例的PLLA 與GelMA 共混的性能，并找出較適合的比例加強特定性能，為進一步將其應用于組織工程提供科學依據.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

左旋丙交酯（L-LA）購于廣東惠州華陽醫療器械公司；明膠，甲基丙烯酸酐，Lrgacure2959 購于Aladdin公司；本實驗所用試劑均購于廣東惠州南源化玻有限公司，所有試劑均為市售分析純.

熱重分析（TG）：熱重分析采用TGA 209 F1熱重分析儀，升溫區間為35-600 ℃，升溫速率為10K/min，吹掃氣為氮氣，流量為20mL/min，保護氣為氮氣，流量為20mL/min.

差示掃描量熱分析（DSC）：TA instruments MDSC 2910，氮氣氣氛（40 mL/min），測定二次升溫曲線.每個樣品質量為3-5mg，升降溫速率為10 ℃/min，樣品掃描溫度范圍為0-250℃.

X－射線衍射分析（XRD）：日本RIGAKU 公司Ultima Ⅳ型X 射線衍射儀，廣角測量，2θ 角為3°-60°，速度5°/min.

掃描電鏡分析：室溫下噴金.在5 kV 加速電壓下FE-SEM（SU8010 field emission scanning electron microscope，Hitachi LTD，Tokyo，Japan）觀察導管橫斷面形貌.

1.2 實驗過程

1.2.1 聚左旋丙交酯（PLLA）的制備

采用封管本體聚合方式制備共聚物.安瓿瓶經洗液浸泡（加熱至60-70 ℃）、洗凈、烘干，干燥24 h 后備用.將一定量的經純化后的L-LA 單體加入到干燥的30 mL 聚合管中，用氬氣置換3 次，加入異丙醇為引發劑并控制聚合物的分子量（［M］/［I］=600/1），再加入辛酸亞錫的甲苯溶液（［M］/［Cat］=1 000/1），混合均勻，在室溫下抽真空2 h 以除去殘留的溶劑，封管，置于130 ℃的油浴中反應20 h.反應結束后聚合管冷卻至室溫，沿瓶頸切斷后，加入5 mL 氯仿將反應物完全溶解后，用8-10倍氯仿量的冷甲醇沉淀，重復溶解-沉淀兩次，真空干燥24 h得產物.

1.2.2 甲基丙烯?；髂z（GelMA）的制備

稱取定量的明膠，加入到錐形瓶中并加入配置好的適量PBS 溶液.水浴加熱到60 ℃，不停攪拌至明膠全部溶解.待明膠完全溶解后，繼續加熱并逐滴滴加甲基丙烯酸酐進入錐形瓶，持續滴加一個小時.滴加結束兩小時后，將預熱到50 ℃的定量PBS溶液加入到錐形瓶，再持續攪拌15 分鐘.攪拌完畢后將錐形瓶中的溶液倒入透析袋中，透析一周.透析結束后，將收集的液體加熱到60 ℃，用孔徑為0.22微米的微孔濾膜趁熱過濾，然后將所得液體擱置到冰箱預凍過夜，然后放置到冷凍干燥機上進行冷凍干燥得到GelMA白色絮狀材料.

1.2.3 PLLA與Gel-MA復合物的制備

分別稱量左旋聚乳酸（PLLA）與GelMA 比例為1∶4、1∶1、4∶1 的原料，編號為1、2、3.配置0.25%g/ml 的Lrgacure2959 光引發劑溶液.用玻璃培養皿裝取適量光引發劑溶液溶解GelMA，完全溶解后再加入PLLA，并用分散機將粉末打勻，直至PLLA 懸浮在溶液中，整個過程需要避光進行.將制備好的溶液放10mW/cm2紫外燈下進行反應10 分鐘，制成PLLA/GelMA 交聯的水凝膠.

2 結果與討論

2.1 PLLA性能的測定

圖1 PLLA的TG曲線

由圖1可知，圖像中只有一個階梯，表示著只有一個分解過程，PLLA 完全分解.圖2 可知，升溫過程中，圖像先有一個冷結晶峰，再有一個向上的尖銳峰（熔融峰），說明PLLA為半結晶狀態.由圖1和圖2可分析得出PLLA的熱分解溫度為299℃，熔點為166.6 ℃，玻璃化轉變溫度為52 ℃.與所查的文獻資料非常接近，說明合成的聚合物的熱穩定性較好，有且只有一個分解過程，符合均聚物的特點，說明反應物沒有太多副反應發生.

圖2 PLLA的DSC曲線

圖3是PLLA 的XRD 衍射圖像，PLLA 的衍射峰位置在22.19°，結晶度在50%，峰面積占了整個圖像面積的一半左右，圖像有尖銳峰，且峰被隆拱起，說明PLLA為試樣中晶態與非晶態“兩相”共存，PLLA為半結晶物質.

圖3 PLLA的XRD譜圖

2.2 GelMA性能的測定

根據圖4 顯示可知，TG 圖像中曲線有兩個分解過程，第一個分解過程先損失12%，第二個分解過程失重69.3%，還有18.7%未損失.GelMA 是甲基丙烯酸酐修飾過的明膠，其中明膠的熔點在350 ℃左右，甲基丙烯酸酐的沸點在87 ℃，可以看出前一段為甲基丙烯酸酐，后一段為明膠或GelMA，剩余的物質是明膠在高溫下形成的透明堅硬非晶物質.根據圖4 分析測得較大的熱分解溫度為281.9 ℃，TG圖中有兩個分解過程，符合明膠被甲基丙烯酸酐修飾的特點.

圖4 GelMA的TG曲線

2.3 PLLA與GelMA復合水凝膠性能的測定

由前面的分析可知，純的PLLA是均聚物，PLLA與GelMA 的混合物中有一個分解過程，呈現出類似無規共聚物的特點.從圖5 中可以看出，PLLA 與GelMA 的比例1∶4、1∶1、4∶1的共聚物分解溫度分別為235.9 ℃、259.8℃、244.8 ℃，根據所得分解溫度可知當PLLA 與GelMA 的比例為1∶1 時分解溫度最高.由此可知添加GelMA 對PLLA 的熱穩定性有影響，PLLA 與GelMA 的比例為1∶1熱穩定性最佳.

圖5 PLLA、GelMA及復合水凝膠的TG曲線

圖6可知PLLA 與GelMA 的比例1∶4、1∶1、4∶1 的共聚物熔點分別為127.5 ℃、127.5 ℃、117.5 ℃，PLLA與GelMA 的比例1∶4、1∶1 比例的熔融溫度相近，看不出較大的差別，但4∶1 時溫度會較低一點. PLLA 與GelMA的比例1∶4、1∶1、4∶1的各種比例共聚物升溫過程中，不同比例的PLLA 與GelMA 共聚物，在升溫過程中，其DSC曲線先呈現一個下降峰，再有一個向上的尖銳峰（熔融峰）. 說明各比例混合物為半結晶物質.PLLA 與GelMA 的比例1∶4、1∶1、4∶1 的共聚物的玻璃化轉變溫度分別為25℃、25℃、20℃.常溫下各混合物都可以達到玻璃化轉變溫度，其中聚PLLA與GelMA 4∶1比例的玻璃化轉變溫度會更低一點.

圖6 復合水凝膠的DSC曲線

根據XRD 測試的可知，由圖7 和圖8 測試結果顯示，兩個圖均有隆峰，且都有尖銳峰，這表現出部分晶態，也就是說有部分為非晶態.根據各衍射峰的面積之和Sc、彌散隆峰面積Sa 和結晶度＜Xc＞，得出大致的結晶度＜Xc＞=Sc/（Sc+Sa）. 圖7 在17.43°和23.82°有兩個衍射峰，通過計算可得結晶度在18.7%；圖8 的衍射峰位于19.07°，通過計算可得結晶度在15%；它們的衍射峰又細又長，所占的面積很小.根據衍射峰的面積與整個峰面積之比可知，共混之后的結晶度不高，同樣為部分結晶物質.

圖7 PLLA與GelMA1：1復合水凝膠的XRD譜圖

圖8 PLLA與GelMA4：1復合水凝膠的XRD譜圖

由SEM 圖像觀察到三個比例共混后的材料，其中圖9 為PLLA 與GelMA 1∶4 共 混 物SEM 圖，圖11 為PLLA與GelMA 4∶1共混物要SEM圖，二者均呈現團聚集塊狀，物質凝聚成一團，呈現出無規排列的狀態，圖10為PLLA與GelMA1∶1共混物SEM圖，呈現條塊團聚狀，條塊明顯，呈現出層疊狀，結構變得更規整.由此可見，當PLLA 與GelMA 共混比例為1∶1 時，物質結構更規整.

圖9 PLLA與GelMA 1∶4復合凝膠的SEM圖像

圖10 PLLA與Gel-MA 1∶1復合凝膠的SEM圖像

圖11 PLLA與GelMA 4∶1復合凝膠的SEM圖像

3 結論

PLLA 具有眾多優良的性質，它在親水性、生物相容性等還不能完全滿足細胞組織工程和一些生物醫用工程的實際運用.GelMA 是當今常用的3D 打印材料，但是其力學性能的不足也限制著它的發展.為了實現PLLA與GelMA更好的應用，通過共混方法對二者進行改性.結果表明PLLA 與GelMA 的共混物熱力學性能較為穩定，在常溫下基本沒什么變化，PLLA 結晶度下降，使得材料的耐沖擊性增強，韌性變好，延展性變好.觀察其中PLLA與GelMA含量為1∶1時為最佳比例.通過PLLA 與GelMA 共混物的基本性質可知此材料可用于生物醫用材料中.隨著研究的繼續，將探究PLLA與GelMA共混物在醫用方面和3D打印材料的價值.這將是一樣非常有前景的研究方向，而且能帶給人們更多的便利.