納豆發酵原料篩選及其功能產品的開發

龍繼艷，戴明，鐘瑤，李夢鑫，蔣詠梅

（福建師范大學 生命科學學院，福建福州 350007）

納豆風味獨特，是以大豆為原料經蒸煮后接入枯草芽孢桿菌發酵而成的傳統食品，至今已有上千年的歷史。1987年，Sumi等人[1]首次從納豆中提取到納豆激酶，并對其進行系統研究，發現其屬于絲氨酸蛋白酶，具有顯著的溶栓活性，可切開血栓上的纖維蛋白凝塊。除此之外，納豆激酶還可以誘導纖溶酶原激活劑的產生，從而激活自身的纖溶系統[2]。納豆激酶安全無毒，在人體內溫度和pH條件下，性能穩定，半衰期長，能夠溫和持續地預防血栓的形成。除含有納豆激酶外，納豆中的糖肽活性物質、胰蛋白酶抑制劑、異黃酮和多胺等抗癌物質的含量也遠高于原料大豆，食用納豆及相關產品不僅可以防治心血管疾病，還有助于人體健康。

20世紀90年代以來，納豆的發酵工藝已成為研究熱點，除對傳統的大豆固體發酵納豆工藝進行優化之外，人們嘗試了豆粕、豆渣等多種原料[3]，并通過液體發酵方式提高納豆激酶的產量[4]，均取得一定進展。盡管納豆的保健功能已為眾人熟知，但納豆相關產品在我國市場占有率很低，其原因是在納豆發酵過程中，大豆蛋白質降解為氨基酸時產生一種特殊的氨臭味。因此，降低納豆中氨臭味成為其市場化的關鍵所在。本實驗選擇黃豆、綠豆和紅豆作為原料發酵納豆，綜合感官評價、酶活測定和體外溶栓實驗結果，選擇最適原料進行納豆產品的研制，以期為納豆食品的開發提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 原料

納豆芽孢桿菌，本實驗室分離保藏。

1.1.2 儀器與試劑

HWS-250恒溫恒濕培養箱，寧波新藝超聲儀器設備有限公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；GI54DWS高壓蒸汽滅菌鍋，廈門精藝興業科技有限公司；TG16-WSD臺式高速離心機，湖南湘儀儀器有限公司；SW-CJ-2D凈化工作臺，蘇州智凈凈化設備有限公司。

牛纖維蛋白原、牛凝血酶，上海源葉生物科技有限公司；尿激酶，中國食品藥品檢定研究院。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化及種子液制備

斜面保藏菌株接入30 mL液體種子培養基，37 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養24 h。

1.2.2 納豆發酵工藝

分別選取黃豆、綠豆和紅豆，清洗浸泡16 h使之充分吸水膨脹，瀝水后于121 ℃滅菌20 min，冷卻至50 ℃左右，2 %接種量接入種子液，30 ℃恒溫培養24 h，置4 ℃冰箱后熟。

1.2.3 酶液制備

取適量納豆樣品于燒杯中，加入5倍體積NaCl溶液（0.9%），攪拌2 h，4 ℃下10 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

1.2.4 納豆激酶活性測定

采用纖維蛋白平板法[5]。以不同濃度尿激酶標準品（100 U/mL、200 U/mL、300 U/mL、400 U/mL、500 U/mL）各10 μL點樣于纖維蛋白平板，以溶解圈面積為橫坐標，酶活力為縱坐標作圖，繪制標準曲線。以待測粗酶液代替尿激酶標準品，其余條件同上，測量溶解圈的直徑，根據標準曲線計算納豆激酶活力。

1.2.5 納豆激酶體外溶栓實驗

稀釋待測酶液至10倍、50倍、200倍和1 000倍，取原液和各個稀釋液6 mL置于50 mL潔凈干燥離心管中，以pH為7.2的磷酸緩沖液為空白對照。取自然凝固新鮮雞血，分割為1.5 g左右小血塊，分別稱重（W1）后加入上述離心管，37 ℃恒溫水浴，分別于0 h、4 h、8 h、12 h和16 h取出血塊后稱重（W2），根據公式（1）計算溶解率。

1.2.6 納豆糕的研制

納豆碾碎，加入一半重量的炒熟面粉及適量白砂糖，揉捏混合均勻，裝入模具，制成成品。

從氣味、口感、色澤、外型、內部組織5個最為直觀的角度，設計納豆糕感官評定標準如表1所示。

2 結果與分析

2.1 不同原料對納豆發酵的影響

黃豆、綠豆和紅豆分別經清洗浸泡、高壓蒸煮后，進行納豆發酵。感官特征如表2所示，黃豆納豆的豆粒完整、口感綿軟；紅豆納豆的豆粒完整度低、硬度較大，口感較差；綠豆納豆雖完整性較弱，但口感綿軟。不同種類豆粒的內部結構存在差異，因此需要的浸泡時間和蒸煮條件也不相同[6]。根據納豆的菌膜厚度和拉絲長度可初步判斷發酵過程中納豆菌的生長情況。由表2可見，黃豆納豆的菌膜最厚，粘液多，拉絲長約28 cm，說明納豆菌生長良好。相比黃豆，綠豆表面的菌膜較薄，拉絲較短，約15 cm。3種納豆中，紅豆的發酵度最低。黃豆納豆雖發酵完全、口感綿軟，但氨味也十分明顯，比較而言，綠豆和紅豆的氨味均較低，屬于可以接受的范圍。

表1 納豆糕感官評定標準

表2 納豆感官特征

2.2 納豆激酶活力測定結果

如圖1所示，溶解圈面積與納豆激酶活性呈線性正相關，標準曲線方程為Y=4.692 64X-463.707 4，R2=0.996 09。

圖1 尿激酶纖溶性擬合曲線

利用纖維蛋白平板法檢測3種納豆的激酶活性。根據平板上透明圈半徑，通過圖1的標準曲線計算納豆激酶的活性，結果如圖2所示。3種納豆中，黃豆納豆酶活最高，達5 131.65 U/g，綠豆納豆的酶活2 338.02 U/g，紅豆僅139.38 U/g。與目前市售納豆[7]相比，本實驗中黃豆納豆的激酶活性較高，綠豆納豆的酶活性適中，紅豆納豆則明顯低于市售納豆。

2.3 納豆激酶體外溶栓結果

圖2 3種納豆激酶活性

如圖3所示，3種納豆激酶中，溶栓效果最好的是黃豆；3種納豆在18 h內對血凝塊的溶解效率分別為55.8%、37.0%和24.4%，黃豆和綠豆納豆激酶溶栓速率較快，8 h內即可完成，紅豆納豆激酶不僅溶栓效果弱，速度也相對較慢。該結果與3種納豆的激酶活性相對應：隨著酶液稀釋倍數的增加，血塊的溶解效率顯著減弱，可見不同劑量的納豆激酶對血凝塊的溶解率有明顯影響。

2.4 納豆糕的研制

由上述結果可見，黃豆納豆的酶活最高，體外溶栓效果最好，但卻有濃重的令人難以接受的氨味。而紅豆納豆的酶活力和體外溶栓效果均較低，保健價值不高。相比較而言，綠豆納豆不僅有較高的納豆激酶活性和良好的體外溶栓效果，且氨味較淡，具有良好的開發前景。因此，以綠豆納豆為原料進行了綠豆糕的研制，并隨機挑選15位感官評測員，根據表1進行品鑒打分，成品和評分結果見圖4。

圖3 納豆激酶對血凝塊的溶解效果

圖4 納豆糕成品及評價

由圖4A可見，綠豆納豆糕外型美觀、紋路清晰、顏色偏黃、外形完整。由圖4B可見，納豆糕的總體食用性還有待提高。單項指標中，氣味與色澤得分最低，均為8.3分?？梢娋G豆納豆雖優于黃豆納豆，但其氨味仍不容忽視，后期可從改進納豆發酵工藝或調整納豆糕配比兩方面入手進行優化?？诟?、外形、內部組織得分較高?？诟兄笜酥?，大多數評測員選擇“略粘牙”，說明納豆糕的咀嚼感需要改進，可通過添加少許油脂改善口感，若添加過多，反而會引發“三高”癥狀，與納豆糕的保健功能背道而馳。外形評分和內部組織評分較高，部分評測員打分較低的原因是吃到細小的白砂糖顆粒，后續可采用綿白糖替代白砂糖。

本實驗納豆糕是由綠豆納豆、熟面粉和白砂糖3種成分組成，未添加油脂和其他成分，因此在感官評測方面有少許欠缺，后續可針對性增添其他成分，以達到更優的口感和保健效果。

3 結論

選擇黃豆、綠豆和紅豆進行納豆發酵，對3種納豆激酶的活性和溶栓效果進行檢測，發現黃豆為原料發酵納豆的酶活最高，達5 319.30 U/g，體外溶栓效果最好。選擇氨味較弱、納豆激酶活性較高及溶栓效果較好的綠豆納豆進行納豆糕的研制，并對成品進行了感官評測，該結果可對納豆相關食品的開發提供參考。