雙孢蘑菇來源非特異性過氧合酶在畢赤酵母中的表達及生化表征

龐能威，楊博，王永華

（1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州 510006）

（2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

非特異性過氧合酶（Unspecific peroxygenase，UPO，EC 1.11.2.1）屬于血紅素氧化酶超家族的一員[1]，與單加氧酶 P450的催化功能相似，它能對一系列底物進行氧化并表現產物的出位置選擇性和立體選擇性。P450的催化反應需要利用O2分子作為供氧劑，同時依賴 NAD(P)H輔助催化氧化過程的發生。而UPO可直接催化轉移H2O2中的氧分子到底物中，無需額外的輔因子參與，所以 UPO具有更高的工業應用價值。除了催化有機化合物的非活性C-H鍵之外，UPO還可以實現鹵代芳香化合物的氧化[2]、含有C=C鍵化合物的環氧化[3]和硫化物的氧化[4]等，因此其在食品原料加工[5]、醫藥行業[6]和環境治理[7]等領域有巨大的應用潛力。

研究發現，UPO主要存在于雙核菌亞界（Dikarya）和高等真菌界的子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）中[1]。由于真菌孢子難以實現高密度發酵，從而導致大規模獲得野生型UPO十分困難，目前只有少數 UPO被表達和鑒定。因此異源宿主重組表達是獲得 UPO重要的途徑之一，然而異源宿主重組表達具有活力的非特異性過氧合酶一直是巨大的挑戰[8,9]，目前報道的十余種UPO，僅有六種UPO實現了異源表達。隨著高通量基因組測序技術的發展，大量微生物基因組信息被儲存在公共生物數據中。利用生物信息學方法從海量數據中獲得假定的酶基因序列，是獲得有價值酶制劑的重要途徑之一。

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）是自然界中的一種常見食用菌，它具有較強降解腐殖質的能力，因此能更好地適應復雜的營養環境。但是，目前尚不完全了解雙孢蘑菇利用各種養分資源的機制。此前Emmanuelle Morina等[10]提出假說：雙孢蘑菇可能已經進化出了其特有的代謝策略和生態適應性，這都源于它具有的獨特的底物轉化酶，而 UPO正是該類物種特有的酶之一。本研究實現了來自Agaricus bisporus var. bisporus的非特異性過氧合酶（AbvbUPO）基因在畢赤酵母GS115進行異源分泌表達并初步研究了其催化特性，為繼續探究其底物特異性揭示解其環境適應性的可能原因打下基礎，以期獲得生物化工和食品化工領域應用的UPO酶制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒

畢赤酵母表達菌株GS115，質粒pPIC9K均為本實驗室保存，大腸桿菌DH5α感受態細胞購自唯地生物科技有限公司。

1.1.2 生化試劑

限制性內切酶BamHI，高保真DNA聚合酶購自TaKaRa大連生物工程公司；無縫克隆試劑盒購自中美泰和生物技術(北京)有限公司；質粒提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Westernblot的一抗為小鼠抗His-tag單克隆抗體，二抗為山羊抗小鼠IgG（H&L）二抗（HRP標記），均購自金瑞斯生物科技公司。

1.1.3 主要儀器設備

EDG-810型PCR儀，東勝創新生物技術科技有限公司；生化培養箱，重慶市永生試驗儀器廠；DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠；SKY2102C型搖床，SUKUN；全自動凝膠成像儀，BIO-RAD；7000D型 GC-TQ/MS，安捷倫科技有限公司；HP-INNOWax色譜柱，安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 非特異性過氧合酶AbvbUPO序列的合成和分析

AbvbUPO基因序列（XP_006457061.1）委托上海生工生物工程有限公司合成。使用DNAMAN軟件進行序列的對比，使用ESPript[11]（網站）呈現同源比對結果。

1.2.2 非特異性過氧合酶AbvbUPO的基因克隆

利用 PCR擴增技術獲得目的基因片段（上游引物：5’-GAGGCTGAAGCTTACGTAGAATCACCAGG TGCTCCTCCTGGA-3’；下游引物：5’-TTAATGATGA TGATGATGATGGGATCCTTAATTGTCATTCCCATA GGG-3’），擴增條件如下：98 ℃ 5 min，98 ℃ 15 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min 共30 個循環，循環結束后 72 ℃保持5 min。將BamHI單酶切后的pPIC9K載體與擴增得到的目的基因進行連接，轉至DH5α大腸桿菌感受態細胞中并涂布至含有100 μg/mL氨芐青霉素的固體LB平板。次日，提取重組質粒并送往上海生工公司測序。

1.2.3 重組蛋白AbvbUPO的表達

（1）重組酵母的搖瓶發酵：將重組質粒pPIC9K-AbvbUPO電轉化至P. pastorisGS115中，種子液按10%接種量接種至100 mL的BMGY液體培養基中30 ℃、200 r/min培養。24 h后將發酵液低溫離心，去除上清液后加入100 mL的BMMY培養基進行誘導表達，每隔24 h補加0.5 mL的甲醇。甲醇誘導72 h后停止培養，將發酵液進行低溫離心，收集上清液，利用 10 ku截留超濾管進行濃縮，濃縮后用SDS-PAGE凝膠電泳和Western blot檢測AbvbUPO在P. pastorisGS115中的表達情況。

（2）重組酵母的發酵罐發酵：二級種子液按10%接種量接種，30 ℃、200 r/min培養24 h。將培養至對數生長期的二級種子液按 10%（V/V）接種到經過高壓滅菌的5 L發酵罐中（含3 L基礎鹽培養基：26.7 mL/L的85%磷酸，0.93 g/L的CaSO4·2H2O，14.9 g/L的MgSO4·7H2O，18.2 g/L的K2SO4，7.13 g/L 的KOH，40 g/L的甘油，滅菌后加入 PTM1微量元素至 12 mL/L），30 ℃、800 r/min培養。當基礎鹽培養基的甘油被消耗完時，用 50%（V/V）的甘油進行補料（含12 mL/L的PTM1微量元素），流速根據溶氧（DO）調整，使溶解氧濃度保持在40%左右。當濕重達到160 g/L時停止補料并饑餓培養1 h，饑餓培養結束后，將溫度設為22 ℃，pH控制在6.0左右。流加甲醇進行低溫誘導使其溶氧控制在40%左右至132 h。酶液用10 ku切向流超濾膜包進行濃縮后檢測重組蛋白的表達情況和酶活力。

1.2.4 UPO活力檢測

本實驗用2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）作為底物檢測AbvbUPO的酶活[12]。1個酶活力單位定義為：在25 ℃和pH 4.0條件下，每分鐘水解1 μmol底物（ABTS）生成對應產物（ABTS自由基）所需的酶量為1個酶活單位(U)。

1.2.5 SDS-PAGE和Westernblot檢驗

SDS-PAGE：將蛋白質樣品用5%的濃縮膠濃縮，并通過 10%的分離凝膠進行不同分子量蛋白質的分離，最后將分離凝膠用考馬斯藍R250染色。

Westernblot：將裝有SDS-PAGE凝膠和0.2 μm聚偏二氟乙烯膜（PVDF）的電轉印夾放入電泳槽中低溫轉印。轉印結束后，PVDF膜用 5%（m/V，TBST溶解）脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后與小鼠抗His標簽抗體（Genscript，中國上海）一起低溫過夜孵育，孵育結束后用TBTS緩沖液清洗，隨后用山羊抗小鼠IgG（H&L）二抗（HRP標記）孵育，最后用DAB顯色液（Solarbio，中國上海）顯色以驗證重組 His-tag-AbvbUPO蛋白。

1.2.6AbvbUPO的酶學性質表征

1.2.6.1 粗酶液的緩沖液置換

為了避免酶發酵液中離子成分對酶活力造成影響，進行酶活性評估前需對原有的緩沖液進行置換。利用10 ku孔徑截留的超濾管置換緩沖液，按照粗酶液與20 mM的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）的比例為1:10添加磷酸鹽緩沖液，置換緩沖液多次至發酵罐緩沖液成分為微量為止。

1.2.6.2 最適反應溫度和熱穩定性

最適反應溫度：按照方法1.2.4的活性檢測方法，檢測25～42 ℃范圍內AbvbUPO酶液催化ABTS的活性變化。緩沖體系為 100 mM 的磷酸鈉緩沖液（pH 4.0），反應時間為10 min。熱穩定性：測定AbvbUPO酶液在30、35和40 ℃下孵育10～120 min下的殘余酶活力。

1.2.6.3 最適反應pH

以ABTS為底物，在pH范圍為3.0～7.0的緩沖液下測酶活性的變化，其他條件保持不變。其中 pH 3.0～5.0范圍所使用緩沖液為100 mM的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 6.0～7.0的范圍所使用緩沖液為100 mM磷酸鹽緩沖液。

1.2.6.4 過氧化氫耐受性

將AbvbUPO酶液與不同濃度（2、5、10、20 mM）的H2O2進行等體積孵育，孵育5 min后按照反應體系內H2O2等量的原則調整加入H2O2的量進行殘余活力測定。

1.2.6.5 酶級聯催化反應及產物檢測

向5 mL旋蓋玻璃瓶中依次添加400 μL的50 mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）、100 μL的1 M氯化膽堿溶液，充氧后，加入50 μL的100 μM膽堿氧化酶（AnChOx）酶液，400 μL的AbvbUPO酶液，5 mM乙基苯，最后用50 mM的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）補足1 mL。玻璃瓶放置于恒溫油浴鍋，于反應溫度為 30 ℃、攪拌速度為500 r/min條件下反應，反應結束后用乙酸乙酯萃取，離心后取上層有機層進行GC-MS檢測分析。

GC-MS檢測升溫條件：以10 ℃/min的升溫速率從最初的50 ℃升溫至190 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的升溫速率從190 ℃升溫至230 ℃，然后保持6 min。

產物濃度的計算：精確稱取β-苯乙醇，配置成1、2、3、4、5 mM的β-苯乙醇溶液，通過對標準品進行GC-MS檢測，根據氣相色譜圖的吸收峰繪制β-苯乙醇的濃度標準曲線。將萃取物中保留時間與產物相對應的吸收峰代入標準曲線即得產物濃度，苯乙酮的含量僅為相對定量。

1.2.7 數據處理

用Origin 8.5軟件作圖并用SPSS 9.0進行統計學分析。

2 結果與討論

2.1 非特異性過氧合酶AbvbUPO序列比對分析

對目前報道的UPO酶基因進行分析，發現UPO催化保守序列為 Pro-Cys-Pro（PCP）、Glu-Gly-Asp（EGD）和酸堿催化劑對 Arg-Glu（R-E），其中 Arg和Glu充當酸堿對在過氧化物酶催化活性中間體的形成起著重要的穩定作用[8]。AbvbUPO成熟肽基因的分子量為984 bp，編碼328個氨基酸，蛋白分子量理論值大小為 35 ku，DNAMAN軟件序列比對分析發現AbvbUPO 與Agrocybe aegeritaUPO（AaeUPO）、Coprinus radiansUPO和Coprinopsis cinereaUPO中氨基酸序列存在38.64%～62.93%的相似性。同源序列對比如圖1所示，AbvbUPO具有UPO的催化保守序列，即 Pro81-Cys82-Pro83，Glu168-Gly169-Asp170和Arg235-Glu242，提示AbvbUPO可能具有UPO的催化特性。

圖1 AbvbUPO的序列比對及同源性分析Fig.1 Multiple sequence alignment of AbvbUPO and its homologs

2.2 非特異性過氧合酶AbvbUPO基因克隆及表達

質粒譜圖如圖2所示，基因片段與帶有組氨酸標簽的pPIC9K載體連接后轉化至大腸桿菌DH5α感受態中。菌落PCR呈陽性的轉化子送往測序中心測序，進一步確認AbvbUPO成功克隆到pPIC9K載體上。

真核表達系統具有完善的翻譯后修飾功能，可有效提升異源表達的蛋白可溶性及活性，因此選用了畢赤酵母GS115作為表達宿主。然而畢赤酵母重組菌在搖瓶發酵中，沒有檢測出目的蛋白條帶及酶活，故將畢赤酵母重組菌在 5 L發酵罐中進行高密度發酵，Western blot結果顯示AbvbUPO在畢赤酵母GS115中表達的分子量為 35 ku（圖 3）。濃縮酶液具有氧化ABTS底物的酶活力，其 132 h發酵單位活力為45399.26 U/L。實驗結果與Miguel Alcalde等[9]的研究結果一致，克隆至畢赤酵母X33的野生型AaeUPO在小型發酵中，表達量幾乎無法達到檢測限，提示野生型UPO的表達量低，小型發酵無法達到UPO的蛋白質及酶活的檢測水平。目前，僅有AaeUPO在酵母中得以表征，Miguel Alcalde等[13]在畢赤酵母中，利用發酵罐高密度發酵AaeUPO定向進化后的突變體PaDa-I，培養6 d酶活可達232000 U/L。

圖2 質粒譜圖和瓊脂糖凝膠電泳檢測菌落PCRFig.2 Plasmid and agarose gel electrophoresis of colony PCR

圖3 SDS-PAGE和Western blot檢測重組蛋白在P. pastoris GS115中表達Fig.3 SDS-PAGE and western blot analysis of the expression of the recombinant protein in P. pastoris GS115

2.3 AbvbUPO的酶學性質表征

2.3.1 溫度對AbvbUPO活力的影響

圖4 非特異性過氧合酶AbvbUPO最適反應溫度Fig.4 Optimum temperature of AbvbUPO

本實驗針對酶反應時的最適溫度和熱穩定性進行考察。如圖4所示，AbvbUPO酶液的最適反應溫度為35 ℃、30 ℃和 40 ℃可保持最大活力的 73.39～78.40%（圖4）。目前被研究最透徹的AaeUPO的最適反應溫度為30 ℃[14,15]，其余關于UPO催化研究的報道，但研究設計溫度普遍設置在 23～40 ℃之間[3,16,17]，提示 UPO無法在高溫下實現高效催化反應，AbvbUPO亦然。

酶的熱穩定性實驗顯示，AbvbUPO在不同溫度孵育10 min后，酶活性急劇降低，40 ℃下孵育10 min之后，僅呈現 52.97%的活性（圖 5），這表明該酶蛋白解折疊所需要的能量較低，推測是 UPO的普遍特征。Diana等[18]對AaeUPO的熱孵育實驗也表明UPO的熱不穩定性，在63 ℃孵育5 min后，AaeUPO的活力下降超過80%。提高UPO的最適反應溫度和熱穩定性，對于UPO的研究有著重大意義。

圖5 非特異性過氧合酶AbvbUPO熱穩定性Fig.5 Thermostability of AbvbUPO

2.3.2 溶液pH對AbvbUPO活力影響

圖6 AbvbUPO催化ABTS底物的最適pHFig.6 Optimum pH of AbvbUPO catalyzing ABTS

酶活檢測體系不變，僅對緩沖液的pH進行調整，由于pH小于3.0時，反應體系內會出現蛋白質析出的現象，故僅對pH大于3.0的緩沖液進行比較（圖6）。結果顯示，AbvbUPO催化ABTS的最適pH為3.0～4.0，與AaeUPO[9]和Marasmius rotulaUPO（MroUPO）[19]的最適pH一致，表明該酶為酸性條件下催化ABTS活性更佳。

2.3.3AbvbUPO過氧化氫耐受性

UPO是血紅素氧化物酶（HTP），需要H2O2作為共底物，然而氨基酸可能會被 H2O2氧化，從而影響酶的活性[20]，此外，H2O2可能將血紅素氧化為α-內消旋-羥基-血紅素，導致HTP的不可逆失活[21]。所以利用UPO作為生物催化劑時往往需要探索適當的H2O2濃度以降低酶活力的損失。結果表明，AbvbUPO不適宜在高濃度 H2O2的環境下長時間進行生物催化，AbvbUPO被5 mM的H2O2孵育5 min后，酶活力僅為初始活性的54.98%（圖7）。據報道[8]，在不同濃度H2O2與AaeUPO共底物的催化實驗中，當H2O2濃度大于2.5 mM時，產物的生成率會隨著過氧化氫濃度的升高而降低，Karich Alexander等[22]提出，UPO的活性的降低與血紅素的丟失有關，推斷是由于反應中的羥基自由基使血紅素形成綠色素和膽綠素進而終止催化反應。為了更真實地反映其底物選擇性和催化潛力，需要建立一種降低反應體系中 H2O2濃度的辦法來降低其在催化過程中的酶活損失。

圖7 AbvbUPO過氧化氫耐受性Fig.7 H2O2-tolerance of AbvbUPO

2.4 AbvbUPO參與的級聯催化反應體系建立

圖8 AbvbUPO酶級聯反應示意圖Fig.8 Figure of AbvbUPO enzymatic cascade reaction

表1 AbvbUPO酶級聯反應產物得率表Table 1 Productyield of AbvbUPO enzymatic cascade reaction

如上文所述，AbvbUPO不耐受高濃度的H2O2，因此采用原位生成 H2O2的酶級聯反應代替一次性加入過量的H2O2作為共底物[14,23]。本實驗原位生成H2O2方法（圖 8）是使用氯化膽堿作為電子供體，通過來自煙草節桿菌來源的膽堿氧化酶還原分子氧來產生H2O2。β-苯乙醇是一種重要的食用香精香料，被廣泛地應用在食品風味提升工藝之中[24]，而它的底物乙基苯也是 UPO的常用底物[14]，因此利用該催化反應驗證AbvbUPO級聯催化反應活性可行性。氣質聯用分析結果表明（圖9），保留時間為4.74 min、9.07 min和9.15 min的產物分別為乙基苯、β-苯乙醇及苯乙酮。AbvbUPO能夠氧化乙基苯為β-苯乙醇，且4 h內轉化率可達14.40%，但隨后轉化率逐漸降低，推測是該酶熱穩定性弱，長時間30 ℃孵育會造成酶活力的損失，同時產物中伴有副產物苯乙酮，因為反應過程中苯乙醇產物被AbvbUPO繼續氧化，導致了苯乙酮的生成。Frank Hollmann等人[5]研究AaeUPO羥基化乙基苯的反應實驗表明，反應前期苯乙酮會大量增加，因為苯乙醇的積累抑制了過氧化，在反應30～60 min時苯乙酮增長速率開始下降并且趨于穩定。本實驗表明，AbvbUPO能與膽堿氧化酶實現級聯催化反應，使AbvbUPO在有機合成及相關領域具有很大的應用潛力。

圖9 GC-MS檢測AbvbUPO酶級聯催化反應Fig.9 GC-MS analysis data of AbvbUPO enzyme cascade reaction

3 結論

本研究將來源于Agaricus bisporus var. bisporus的非特異性過氧合酶AbvbUPO為目標蛋白，在畢赤酵母GS115中成功異源表達，并研究其催化ABTS的最適pH，最適溫度和熱穩定性。除此之外，針對血紅素氧化酶不耐受H2O2的問題進行研究，發現AbvbUPO的H2O2耐受性較差，故通過原位H2O2生成技術，降低反應體系中H2O2的濃度，再串聯AbvbUPO催化底物的氧化。本文研究結果為非特異性過氧合酶的異源表達和進一步研究其底物選擇性搭建了可行的平臺。