響應面法優化超聲波輔助提取小米多酚*

張春穎 李 楠*

（運城學院生命科學系，山西運城 044000）

小米（Setaria itatica），又稱粟，是禾本科狗尾草屬植物粟或谷子的種仁，是我國北方地區主要雜糧作物之一，居五谷之首。近年來多酚已經成為國內外學者研究的熱點之一，有研究表明，小米中酚類化合物含量較高，種類較多，包括黃酮類、酚酸類、花色苷類等。酚類化合物可以清除體內自由基，具有較強的抗氧化活性以及預防與氧化應激有關的疾病等作用。

小米品種不同，多酚的種類及含量也不同。本文以沁州黃小米為原料，采用超聲波輔助有機溶劑提取法，利用超聲波的空化效應，使小米多酚與溶劑充分混合，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化提取工藝，以期得到沁州黃小米多酚的最佳提取工藝，為沁州黃小米資源的進一步開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沁州黃小米，山西省長治市武鄉縣。

沒食子酸，國藥集團化學試劑有限公司；Folin 試劑、石油醚、無水乙醇、無水碳酸鈉，均勻分析純。

1.2 儀器與設備

UV-5500 紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；TDL6M型低速離心機，湖南湘立科學儀器有限公司；HH-4 數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；FA 1604 型電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；KQ-300GDV 超聲波清洗器，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

小米除雜后，用粉碎機粉碎，過篩（50 目），然后用石油醚按料液比1∶2 脫脂處理72 h，干燥箱干燥，備用。

1.3.2 單因素試驗

固定料液比1∶10，超聲時間40 min，超聲溫度40 ℃，研究乙醇體積分數（50%、60%、70%、80%、90%） 對多酚得率的影響。

固定料液比1∶10，超聲溫度40 ℃，乙醇體積分數70%，研究超聲時間（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min） 對多酚得率的影響。

固定料液比1∶10，超聲時間40 min，乙醇體積分數70%，研究超聲溫度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃） 對多酚得率的影響。

固定超聲溫度40 ℃，超聲時間40 min，乙醇體積分數70%，研究料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14） 對多酚得率的影響。

1.3.3 響應面試驗

根據單因素試驗結果，利用Design Exper10.0軟件Box-Benhnken 中心組合試驗設計，以小米多酚得率為判定指標，3 個較為顯著的因素為自變量設計因素水平表，見表1。

表1 響應面因素水平表

1.3.4 多酚含量測定

依次取0.1 mg/mL 沒食子酸溶液0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL 于50 mL容量瓶中，加入3 mL Folin 試劑，25 mL 蒸餾水，靜置5 min，加入9 mL10%的碳酸鈉溶液后定容至刻度。避光反應30 min，以蒸餾水為空白對照，在760 nm 處測定吸光值。重復3 次測得出平均值，繪制多酚標準曲線。

準確量取5 mL 樣液，按照上述方法測定吸光度值。根據標準曲線計算多酚含量。

2 結果與分析

2.1 多酚標準曲線

以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，見圖1，標準曲線方程為：y=0.097 4x-0.012 1，相關系數R2=0.993 7。

圖1 多酚標準曲線

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對多酚得率的影響

乙酚體積分數對多酚得率影響結果見圖2。

圖2 乙醇體積分數對多酚得率的影響

由圖2 可以看出，隨著乙醇體積分數升高，多酚得率先升高后下降。乙醇體積分數不同，提取溶劑的極性不同，導致溶出的有效成分不同，乙醇體積分數為70%時，小米多酚得率最高。因此，選擇乙醇體積分數70%較為適宜。

2.2.2 超聲時間對多酚得率的影響超聲時間對多酚得率的影響結果見圖3。

圖3 超聲時間對多酚得率的影響

由圖3 中可以看出，多酚得率隨著提取時間的增加而升高，當提取時間超過40 min，多酚得率逐漸下降。原因是提取時間過短，提取不充分，導致得率偏低；提取時間越長，超聲波產生的高速震動空化效應會破壞樣液中的多酚類物質，使得率下降，并且提取時間過長，會使其他物質溶出較多，不利于后續純化。因此選擇超聲時間40 min 較適宜。

2.2.3 超聲溫度對多酚得率的影響超聲溫度對多酚得率的影響結果見圖4。

圖4 超聲溫度對多酚得率的影響

由圖4 可以看出，隨著提取溫度升高，多酚得率先增加后下降，當溫度為40 ℃時，多酚得率最高。溫度升高可以提高物質的溶解度，然而溫度過高可能導致小米中多酚物質被熱分解，破壞已經提取出的多酚結構，使多酚得率下降。因此，選擇超聲提取溫度40 ℃為宜。

2.2.4 料液比對多酚得率的影響

料液比對多酚得率影響結果見圖5。

圖5 料液比對多酚得率的影響

由圖5 可知，隨著提取溶劑體積的增加，多酚得率先升高后趁于平穩。當料液比超過1∶10 后，得率呈現穩定趨勢。料液比達到一定程度時，多酚基本溶出，繼續增加料液比會造成原材料浪費和經濟損失。因此，選擇料液比1∶10 為宜。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析

根據單因素試驗結果，從中選取了3 個對得率影響顯著的因素進行3 水平3 因素響應面試驗，試驗結果見表2。以多酚得率為響應值，得到二次回歸模型為： Y=73.83 ＋3.29A ＋0.68B－2.17C ＋1.70AB－3.84AC－0.36BC－11.91A2－7.78B2－7.58C2，其中A 為乙醇體積分數，B 為超聲時間，C為超聲溫度。

表2 響應面試驗設計與結果

表3 方差分析表

3 結論

通過單因素和響應面優化試驗，得出超聲波輔助提取沁州黃小米多酚的最佳工藝條件為：乙醇體積分數72%，超聲時間41 min，超聲溫度38 ℃，在此工藝條件下多酚得率預測值為74.34 mg/100g，驗證試驗結果為74.34 mg/100g，接近預測值。說明該模型可以有效預測沁州黃小米多酚的超聲波提取工藝參數，為沁州黃小米多酚的提取及綜合利用提供一定的理論參考。

對模型進行方差分析，結果見表3。該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.122 7），說明該模型具有統計學意義，能較好的預測小米多酚的得率。其決定系數RAdj2=0.958 6，說明該模型相關性較好。一次項A（乙醇體積分數），交互作用項AC，二次項A2、B2、C2對多酚得率影響極顯著（P＜0.01），一次項C（超聲溫度） 對多酚得率影響顯著（P＜0.05），其余因素影響不顯著。各個因素對多酚得率影響的主次順序為乙醇體積分數＞超聲溫度＞超聲時間。

2.3.2 等高線圖及響應曲面圖分析

圖6、圖7～8 見下頁分別為各個因素交互作用與響應值之間的等高線及響應曲面圖。由等高線圖可以看出，AC 交互作用的等高線最接近橢圓，響應曲面最陡，所以AC 交互作用對得率的影響最顯著；BC 交互作用的等高線接近圓形，相應曲面較平，說明BC 交互作用對得率的影響較小。

2.3.3 提取工藝優化及驗證試驗

結合回歸方程和響應面結果分析，超聲波輔助法提取小米多酚的最優工藝條件為：乙醇體積分數71.727%，超聲時間40.671 min，超聲溫度38.117 ℃，此時得率為74.34 mg/100g?？紤]到實際操作，將工藝條件調整為乙醇體積分數72%，超聲時間41 min，超聲溫度38 ℃，進行3 次平行試驗，多酚得率平均值為74.13 mg/100g，與理論值基本吻合，說明該模型能較好的預測小米多酚得率。

圖6 超聲時間和乙醇體積分數對多酚得率的影響

圖7 超聲溫度和乙醇體積分數對多酚得率的影響

圖8 超聲溫度和超聲時間對多酚得率的影響