β-乳球蛋白聚乙二醇定點修飾物的制備及其抗原性變化

劉成梅，江辛琳，李冬梅，周 磊，鐘俊楨，吉 莉，羅舜菁,*

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西丹霞生物科技股份有限公司，江西 鷹潭 335200）

牛乳過敏是一種常見的食物過敏反應。在導致牛乳過敏反應的蛋白中，β-乳球蛋白（beta-lactoglobulin，β-LG）被認為是主要的過敏原[1]。采用共價修飾技術降低β-LG抗原性[2]已成為國際乳制品加工技術研究的重點。但常用共價修飾手段如糖基化[3]、磷酸化[4]等隨機修飾，存在修飾位點選擇性低、穩定性不理想、修飾產物不均一等問題。研究表明β-LG抗原性同時受線性表位和構象表位影響[5]，共價修飾發生在不同位點會對蛋白構象及抗原性產生不同影響[6]。為明晰不同位點共價修飾對β-LG抗原性的影響，實現共價修飾對β-LG抗原性的有效調控，需采用定點修飾技術以制備均一化修飾產物。

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）定點修飾技術，是能針對特定基團或專一位點進行修飾的共價修飾方法。PEG在人體內代謝簡單、毒性小，具有較好的生物相容性、低免疫原性和生物學惰性，其安全性已經過FDA認證[7]。目前關于β-LG的PEG化研究較少，Nijs[8]和Zhong Junzhen[9]等利用第一代PEG隨機修飾對β-LG進行修飾，但修飾很大程度上存在隨機性，修飾產物多為不同修飾度及同分異構體的混合物且修飾率低[10]。本研究團隊采用PEG定點修飾技術針對β-LG不同位點進行修飾以系統地探究不同位點對β-LG抗原性的影響，前期分別對β-LG的N-末端氨基[11]、谷氨酰胺殘基[12-13]進行了定點修飾產物的制備，在單修飾產物的制備中，發現不同修飾條件會產生不同修飾度的修飾產物，修飾條件對產物修飾率及純度影響極大，若選取不當還會導致修飾產物難以分離純化。并且針對不同基團進行PEG修飾能不同程度改變β-LG構象并有效降低β-LG抗原性。

在PEG蛋白修飾常用基團中，巰基因其含量少成為PEG定點修飾中的理想位點[14]，目前針對β-LG巰基使用PEG定點修飾的鮮見報道。并且β-LG第121位半胱氨酸（Cys121）游離巰基位于被97%人血清識別的主要抗原表位肽段AA102-124中[15]，游離巰基或是探究不同結合位點對β-LG抗原性影響及實現β-LG致抗原性調控的關鍵位點。因此本研究針對β-LG Cys121游離巰基，選擇5 kDa單甲氧基聚乙二醇-馬來酰亞胺（methoxyPEG-maleimide，mPEG-MAL）對其進行定點修飾（圖1），以期獲得高修飾率β-LG PEG定點修飾產物，并對修飾前后β-LG抗原性進行探究。

圖1 β-LG與mPEG-MAL共價結合示意圖Fig. 1 Schematic diagram of β-LG/mPEG-MAL covalent binding

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳β-LGAB、兔抗β-LG IgG一抗、明膠 美國Sigma-Aldrich Chemistry公司；5 kDa mPEG-MAL北京鍵凱科技股份有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒及4×上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗兔IgG酶標二抗、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 北京索萊寶科技有限公司；三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽（tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，TCEP） 阿拉丁化工有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）西隴科學股份有限公司；蛋白Marker 美國Thermo公司；所有試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

Mini-PROTEAN小型垂直電泳儀、NGC Quest 10 Plus中高壓層析系統、Enrich SEC70 10×300凝膠柱美國Bio-Rad公司；SP Sepharose Fast Flow色譜柱（25 mL）美國GE公司；Five Easy Plus pH計、ME104型電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Simplicity UV超純水系統、ME104型電子分析天平、Amico Ultra-15超濾離心管 美國Millipore公司；SYC-A水浴恒溫搖床 常州金壇精達儀器制造有限公司；HH-2型數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；Heraeus Multifuge X1R高速冷凍離心機 美國Thermo公司；HF2000酶標儀 北京華安麥科生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 修飾反應條件優化

參考Natarajan等[16]的MAL法，稍作修改。β-LG與20 倍物質的量的mPEG-MAL反應，在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.0，含2 倍物質的量TCEP及2 mmol/L EDTA）中4 ℃反應12 h。以此反應條件為基礎進行單因素試驗。

1.3.1.1 β-LG與mPEG-MAL反應物質的量比

根據1.3.1節方法，β-LG與mPEG-MAL分別以物質的量比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40在0.1 mol/L pH 7.0 PBS（含2 倍物質的量TCEP和2 mmol/L EDTA）中4 ℃反應12 h。分別取樣考察β-LG與mPEG-MAL反應物質的量比對修飾反應的影響。

1.3.1.2 反應時間

根據1.3.1節方法，β-LG與mPEG-MAL以物質的量比1∶20在0.1 mol/L，pH 7.0 PBS（含2 倍物質的量TCEP和2 mmol/L EDTA）中4 ℃反應0、4、8、12、24、48 h。分別取樣研究反應時間對修飾反應的影響。

1.3.1.3 pH值

根據1.3.1節方法，β-LG與mPEG-MAL以物質的量比1∶20在0.1 mol/L，pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 PBS（含2 倍物質的量TCEP和2 mmol/L EDTA）中4 ℃反應12 h。分別取樣考察pH值對修飾反應的影響。

1.3.1.4 TCEP添加量

根據1.3.1節方法，β-LG與mPEG-MAL以物質的量比1∶20在0.1 mol/L，pH 7.0 PBS（含不同物質的量TCEP，TCEP為β-LG物質的量的0、1、2、3、4 倍和2 mmol/L EDTA）中4 ℃反應12 h。分別取樣考察TCEP添加量對修飾反應的影響。

1.3.1.5 乙醇體積分數

根據1.3.1節方法，β-LG與mPEG-MAL以物質的量比1∶20在0.1 mol/L，pH 7.0 PBS（含2 倍物質的量TCEP，2 mmol/L EDTA及不同體積分數乙醇0%、5%、10%、15%、20%、25%）中4 ℃反應12 h。分別取樣考察乙醇體積分數對修飾反應的影響。

1.3.2 SDS-PAGE測定樣品

電泳凝膠濃縮膠5%，分離膠12%[17]，將30 μL蛋白樣品與10 μL 4×上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）混合，于100 ℃水浴鍋中煮沸7 min至變性，冷卻后離心2 min；加樣，每孔約10 μL樣品；濃縮膠電泳80 V、15 min，分離膠以120 V約50 min電泳至使溴酚藍條帶到達電泳膠底部；染色，取出凝膠置于考馬斯亮藍染色液中染色2 h左右；脫色，使用蒸餾水漂洗凝膠數次后，置于脫色液中脫色直至蛋白條帶清晰。

1.3.3 凝膠過濾色譜分析

參考甘克明[11]和薛曉瑩[18]，通過凝膠過濾色譜分析不同反應條件下修飾產物的修飾率。反應混合液通過Bio-Rad Enrich SEC70 10×300凝膠柱進行分析，洗脫緩沖液為0.01 mol/L的PBS，流速為1 mL/min，檢測波長為280 nm。修飾率的計算，通過自帶軟件積分計算產物各組分峰面積。

1.3.4 陽離子交換層析

修飾產物通過陽離子交換層析進行分離純化得到，參考Zhong Junzhen[9]和Yu Pengzhan[19]等的方法，將修飾混合液經陽離子層析交換柱SP Sepharose Fast Flow進行分離。洗脫液A：0.04 mol/L，pH 4.5乙酸鈉緩沖液；洗脫液B：0.04 mol/L，pH 4.5乙酸鈉緩沖液+1.0 mol/L NaCl；首先用洗脫液A平衡柱子，流速為2 mL/min；進樣，使用洗脫液B 進行梯度洗脫，洗脫梯度為0%～100%，流速為2 mL/min，洗脫90 min，檢測波長為280 nm。收集洗脫峰，使用SDS-PAGE對洗脫峰進行鑒定。大量收集樣品后使用截留分子質量10 kDa的Amico Ultra-15超濾離心管對目標峰產物于4 ℃、6 000 r/min離心15 min，并使用0.1 mol/L pH 7.0 PBS置換樣品中洗脫液，濃縮得到樣品。

1.3.5 游離巰基含量測定

使用Ellman試劑對修飾前后β-LG樣品游離巰基含量進行測定。將樣品配制為1 mg/mL，取50 μL待測樣品與加入4 mL Tris-Gly緩沖液中，于25 ℃恒溫1 h。加入25 μL 0.01 mol/L 5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)混合均勻，靜置。使用紫外分光光度計測定檢測波長為412 nm處吸光度（A412nm）。以5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)在波長412 nm處消光系數13 600 L/（mol·cm）計算游離巰基含量。游離巰基含量以每克蛋白的物質的量計（μmol/g）[20-21]。

1.3.6 抗原性測定

采用間接競爭ELISA法測定修飾前后蛋白樣品抗原性。包被：每孔加入100 μL 2.5 μg/mL包被抗原4 ℃過夜；洗板，拍干，封阻：每孔加入250 μL 1%明膠，37 ℃溫育1 h。洗板，拍干，每孔加入50 μL待測樣品及50 μL兔抗β-LG抗體（1∶5 000稀釋），37 ℃溫育1 h；洗板，拍干，每孔加入100 μL HRP標記羊抗兔酶標二抗（1∶7 000稀釋），37 ℃溫育2 h；洗板，拍干，每孔加入100 μL TMB顯色液，37 ℃避光反應15 min；終止反應：每孔加入100 μL 1 mol/L H2SO4溶液；使用酶標儀于波長450 nm處測定吸光度。每個樣品平行做3 次，取平均值。以不同濃度梯度β-LG對數為橫坐標，各濃度梯度β-LG對應吸光度為縱坐標繪制標準曲線?？乖宰兓拾聪率絒22]計算：

式中：A0為無競爭對照孔吸光度；A1為β-LG吸光度；A2為待測樣品吸光度。

1.4 數據統計與分析

實驗數據均為3 次重復的平均值，使用Origin 9.0軟件作圖，使用SPSS 17.0軟件分析數據顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 β-LG與mPEG-MAL反應物質的量比對修飾反應的影響

圖2 β-LG與mPEG-MAL反應物質的量比對SDS-PAGE（a）及修飾率（b）的影響Fig. 2 Effect of molar ratio of β-LG to mPEG-MAL on modification efficiency

如圖2a所示，條帶1～6對應修飾率分別為3.2%、11.3%、18.6%、26.3%、41.2%、41.9%（圖2b）。產物修飾率隨mPEG-MAL添加比例的增加而升高，反應物質的量比達1∶30后，增加PEG的量修飾率變化不明顯。因此選擇1∶30作為最佳蛋白與PEG物質的量比。

2.1.2 反應時間對修飾反應結果的影響

圖3 反應時間對SDS-PAGE（a）及修飾率（b）的影響Fig. 3 Effect of reaction time on modification efficiency

如圖3a所示，條帶1～6對應修飾率分別為4.1%、18.3%、23.6%、31.4%、42.1%、42.8%（圖3b）。當反應時間超過24 h后，β-LG與mPEG-MAL反應完全，PEG修飾產物的量達到最大。因此選擇24 h作為最佳反應時間。

2.1.3 pH值對修飾反應的影響

如圖4a所示，條帶1～6對應修飾率分別為33.8%、32.1%、34.9%、36.7%、34.2%、35.5%（圖4b）。研究顯示β-LG對溶液pH值變化敏感，在生理pH值下β-LG以非共價二聚體和單體平衡狀態存在，pH值改變可引起β-LG形態在單體與聚集狀態間轉變[23-24]。而實驗中不同pH值下的修飾率無顯著變化，說明此反應條件可能較好地保持β-LG在不同pH值溶液中的穩定性。也可能因PEG鏈包裹在蛋白外部能形成一層獨特的水化層，其對蛋白產生空間屏蔽的保護作用[25]，使得pH值變化對反應產物修飾率影響不顯著，因此選擇生理條件pH 7為最佳反應pH值。

圖4 反應pH值對SDS-PAGE（a）及修飾率（b）的影響Fig. 4 Effect of reaction pH on modification efficiency

2.1.4 TCEP添加量對反應結果的影響

圖5 TCEP添加量對SDS-PAGE（a）及修飾率（b）的影響Fig. 5 Effect of TCEP concentration on modification efficiency

因β-LG蛋白分子含有一游離巰基，β-LG在溶液中常以單體和二聚體形式共同存在[24]。在反應中添加還原劑TCEP，能有效避免蛋白分子間二聚體的形成[26]，以便于mPEG-MAL與β-LG游離巰基的連接。將不同TCEP反應產物進行SDS-PAGE及凝膠過濾色譜分析，圖5a中條帶1～5對應修飾率分別為5.9%、17.9%、32.5%、42.1%、43.2%（圖5b）。隨著TCEP添加量的增加，反應產物修飾率得到顯著提升，當TCEP添加量至蛋白3 倍后，修飾率無顯著變化，因此選擇3 倍物質的量為本實驗最佳TCEP添加量。

2.1.5 乙醇體積分數對反應的影響

圖6 乙醇體積分數對SDS-PAGE（a）及修飾率（b）的影響Fig. 6 Effects of ethanol concentration on modification efficiency

如圖6a所示，條帶1～6分別對應修飾率為35.6%、37.1%、37.8%、40.1%、39.8%、49.2%（圖6b），乙醇體積分數為25%時修飾率達到最高為49.2%。彭飛[27]在水溶液中添加20%比例乙醇溶液使干擾素beta 1b的PEG單修飾產物產率提高20%，一定比例乙醇溶劑能使蛋白二級結構松散發生可逆性改變從而提高修飾率。在本實驗中，當乙醇體積分數達30%時，蛋白出現大量不溶沉淀，說明高濃度乙醇環境蛋白溶解性下降，不適合進行修飾反應，因而未對更高濃度進行條件優化實驗。

綜上，通過單因素試驗，研究不同反應條件對該修飾反應的影響，確定本實驗最佳修飾條件：β-LG與mPEG-MAL物質的量比1∶30，在0.1 mol/L、pH 7.0的PBS（含3 倍物質的量的TCEP，25%乙醇溶液及2 mmol/L EDTA）中4 ℃反應24 h。

2.2 修飾產物的分離純化及修飾率鑒定

β-LG等電點在5.1～5.3左右[28]，修飾所用PEG化合物為電中性不帶電，經修飾后，PEG會屏蔽蛋白表面電荷使蛋白表面所帶電荷有所區別[11]，因此本實驗可采用陽離子交換層析分離純化β-LG-MAL修飾產物。實驗中，β-LG在pH 4.5的緩沖液中帶正電，吸附于帶負電的層析介質中；而β-LG-MAL修飾產物經PEG修飾后與層析介質的結合強度會有所減弱，因此β-LG-MAL修飾產物會先于未修飾的蛋白而被洗脫下來[28]。

圖7 陽離子交換層析純化β-LG-MAL的單修飾產物（a）和洗脫峰SDS-PAGE（b）Fig. 7 Cation exchange chromatogram of PEGylated β-LG (a) and SDS-PAGE analysis of eluates (b)

根據單因素試驗優化得出最佳修飾條件，制備β-LG PEG定點修飾產物，并對優化產物進行分離純化。將修飾混合液經陽離子層析交換柱SP Sepharose Fast Flow進行分離純化，如圖7所示，得到2 個洗脫峰，并通過SDSPAGE對洗脫峰進行鑒定驗證，分析顯示保留時間較短的峰1為β-LG-MAL的單修飾產物（圖7b，條帶2），分子質量約為28 kDa；峰2為未反應完全的β-LG（圖7b，條帶1），分子質量約為18 kDa；β-LG-MAL的單修飾產物表觀分子質量高于單點修飾產物的理論分子質量，是因為當PEG溶于溶液中時，分子中的乙氧基單元易于水分子結合，使其水化半徑增大，表觀分子質量約為PEG實際分子質量的2～3 倍，因此本實驗中制得產物為β-LGMAL的單修飾產物。圖6a顯示陽離子交換層析分離效果較好，優化產物修飾率達64.1%，遠高于β-LG隨機修飾的修飾率38%[29]。

2.3 修飾產物純度的鑒定

大量收集圖7a中峰1，使用截留分子質量為10 kDa的超濾離心管于冷凍離心機中以6 000 r/min離心15 min，濃縮得到β-LG-MAL的單修飾產物樣品（圖7b，條帶3）。取樣通過凝膠過濾色譜測定修飾產物純度，如圖8所示，當洗脫液體積為9.5 mL時所出峰為單修飾產物β-LG-MAL，通過柱層析系統軟件峰面積計算樣品純度達94%。

圖8 β-LG-MAL單修飾產物高效凝膠過濾色譜圖Fig. 8 High performance liquid chromatogram of cysteine-specific PEGylated β-LG

2.4 修飾位點鑒定

β-LG中，每個β-LG單體中含有5 個半胱氨酸殘基，其中Cys66和Cys160、Cys106和Cys119在結構緊密的β-LG內部兩兩形成了2 個二硫鍵[30]，僅有一游離巰基Cys121位于蛋白α-螺旋與β-折疊結構交界面的疏水空腔[31]，第121位半胱氨酸游離巰基是實現PEG定點修飾的理想位點。目前未有對β-LG巰基進行PEG定點修飾的相關研究，因此參考蔡小飛等[22]采用三硝基苯磺酸法測定氨基含量確定PEG衍生物與β-LG氨基的結合情況，因此本實驗通過對游離巰基含量進行測定以確定PEG衍生物與β-LG游離巰基的結合情況。

實驗中所用mPEG-MAL是一種巰基特異性PEG衍生物。mPEG-MAL與Cys121游離巰基的特異性結合結果驗證可以體現在兩方面：首先，對修飾產物進行電泳鑒定發現所得產物為僅有一單一條帶的單修飾產物。若PEG結合在非Cys121的任何巰基，說明蛋白內部二硫鍵打開，存在多個游離巰基，則2.1.1節中在mPEG-MAL加入過量情況下，修飾產物的SDS-PAGE不應為單一條帶，而是出現多修飾條帶，電泳鑒定發現所得產物僅有一單一條帶說明本實驗中蛋白內部二硫鍵保持完好。再者，在蛋白內部二硫鍵保持完好的情況下，β-LG游離巰基含量即β-LG唯一游離巰基Cys121游離巰基的含量。對分離純化后產物進行游離巰基含量測定顯示，經PEG修飾后β-LG游離巰基含量由52.3 μmol/g降為0.3 μmol/g（P＜0.05）（表1），說明修飾產物中Cys121游離巰基含量幾乎降為零，游離巰基已與mPEG-MAL發生共價結合，因此未被檢測到。綜上，可驗證Cys121游離巰基已與mPEG-MAL發生特異性結合。

表1 游離巰基含量測定結果Table 1 Results of determination of free sulfhydryl group

2.5 修飾前后β-LG抗原性分析

圖9 PEG修飾對β-LG抗原性影響Fig. 9 Effect of PEGylation on antigenicity of β-LG

研究顯示PEG修飾能有效降低蛋白免疫原性[8]，然而本實驗經mPEG-MAL對β-LG Cys121游離巰基定點修飾后，β-LG-MAL抗原性顯著提高約25.9%，如圖9所示。本團隊前期采用PEG定點修飾β-LG谷氨酰胺殘基得到產物β-LG-NH2，β-LG-NH2抗原性顯著下降59.04%[12]；對β-LG的N-末端氨基進行修飾得到β-LG-ALD，β-LG-ALD抗原性顯著下降53.8%[11]，該2 種位點修飾使蛋白抗原性下降原因都歸結于PEG鏈對于蛋白的空間屏蔽作用，掩蓋了β-LG表面部分抗原決定簇。本實驗中，PEG的巰基定點修飾卻沒有因PEG鏈的屏蔽使抗原性下降，說明結合位點對β-LG抗原性的影響較PEG鏈的屏蔽作用更為顯著。β-LG中肽段AA41-46、AA102-124和AA149-163為主要抗原表位，分別為92%、97%、89%的人血清識別[15]。實驗中Cys121游離巰基位于被97%人血清識別的主要抗原表位肽段AA102-124中[15]，并且由于β-LG致敏性同時受線性表位和構象表位影響[5]，因此可能是修飾后原處于蛋白內部的致敏位點暴露，或者有新的構象致敏表位形成導致β-LG致抗原性顯著提升。

3 結論與討論

本研究采用PEG定點修飾技術，使用5 kDa mPEGMAL對β-LG第121位游離巰基進行修飾。通過單因素試驗不同條件對修飾反應結果的影響，得到最佳修飾條件：β-LG與mPEG-MAL物質的量比1∶30，在0.1 mol/L、pH 7.0的PBS（含3 倍物質的量的TCEP，25%乙醇及2 mmol/L EDTA）中4 ℃反應24 h，在此條件下蛋白修飾率達64.1%，對比β-LG的PEG隨機修飾定點修飾率有大幅提高，約為傳統修飾的1.7 倍。陽離子交換層析顯示，實驗中所選擇洗脫條件及溶液對β-LG-MAL單修飾產物分離純化效果較好，收集純化產物對樣品純度進行鑒定，所得樣品純度達94%。通過電泳聯合巰基含量檢測對修飾位點進行鑒定確定β-LG第121位游離巰基與mPEG-MAL發生特異性結合。

β-LG-MAL抗原性測定結果前期實驗截然不同，與前期不同位點修飾進行比較，發現共價位點對蛋白抗原性的影響顯著高于PEG鏈對抗原決定簇的屏蔽作用。經巰基修飾后β-LG抗原性提升25.9%，抗原性的提升可能由于修飾后原處于蛋白內部的致敏位點暴露，或者是新蛋白構象致敏表位的形成。本實驗說明與普通共價修飾相比，PEG定點修飾能有效探究不同位點對β-LG抗原性的影響，而對于巰基修飾致使β-LG抗原性提升的機理驗證，還需下一步對修飾前后β-LG構象變化等進行探究以確定β-LG構象、結合位點與抗原性之間的關系。