堿性蛋白酶限制性酶解對藍圓鲹分離蛋白功能特性的影響

孫樂常，劉偉峰，林怡晨，趙阿云，張凌晶，翁 凌，曹敏杰,*

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.水產品深加工技術國家地方聯合工程中心，福建 廈門 361021；3.海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 大連 116034）

海洋魚類水產品肌肉具有高蛋白、低脂肪的特點，其蛋白中必需氨基酸含量高、分布均衡，是理想的優質食物蛋白。2017年，我國海洋魚類產量951.74萬 t，其中海洋捕撈魚類產量820.85萬 t，而低值經濟魚類年捕撈量則高達412.35萬 t，占總海洋魚類捕撈量的50.23%[1]。隨著海洋捕撈資源的日益匱乏，如何高效利用與開發低值海洋經濟魚類的優質蛋白資源是當前水產品精深加工領域研究的重點[2]。

目前，國內外針對水產魚類蛋白的開發與應用主要是通過多酶或單酶的酶解方法，制備具有抗氧化活性[3]、礦物質離子螯合活性[4]、降血壓活性[5]以及抗凝血活性[6]功能的小分子生物活性肽。另一方面，通過一定的加工手段對蛋白進行修飾改性，可顯著提高蛋白的乳化性、溶解性、分散性以及起泡性等功能特性，將其作為新型蛋白配料應用于各類食品中，能進一步改善食品的品質[7-11]。其中，利用商業化蛋白酶對蛋白原料進行一定程度的限制性酶解是蛋白修飾改性的主要手段之一。迄今為止，限制性酶法改性研究多集中在植物蛋白方面，如：Klost等[7]通過胰蛋白酶水解以改善豌豆分離蛋白的溶解度和乳液的整體穩定性；Thaiphanit等[8]在堿性蛋白酶對椰子蛋白進行處理時發現酶解蛋白的水解度（degree of hydrolysis，DH）為8.25%～10.17%的蛋白乳化活性最好，說明特定的限制性酶解能有效提高蛋白的功能特性。類似結果在國內也有研究報道，如Xu Xingfeng等[9]發現胰蛋白酶酶解可以顯著改善稻谷蛋白的功能特性。目前對于酶解提升動物蛋白功能特性的研究主要集中在蛋清蛋白[10]與乳清蛋白[11]，而關于酶解對水產動物肌肉蛋白功能特性的影響則鮮見報道。

藍圓鲹是我國重要的低值海洋經濟魚類之一，據統計，2017年藍圓鲹全國捕撈總量達53.52萬 t，其中福建省捕撈量為24.37萬 t，位居全國首位[1]。前期研究發現，采用等電點沉淀制備得到的藍圓鲹堿分離蛋白不僅營養價值與消化性高，而且無明顯魚腥等不良氣味，具有很好的開發前景[12]。本研究擬以藍圓鲹堿分離蛋白為對象，采用堿性蛋白酶限制性酶解制備酶解蛋白，研究DH對酶解蛋白溶解性、持水性、持油性、乳化性和起泡性等功能特性的影響，旨在為水產蛋白在食品配料蛋白領域的應用提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰鮮藍圓鲹（均質量約150 g/尾）購于廈門市夏商水產批發市場；壓榨葵花仁油 市售。

堿性蛋白酶（5.0×104U/g） 無錫諾維信酶制劑公司；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、8-苯胺基-1-萘磺酸銨鹽（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，ANS） 美國Sigma公司；考馬斯亮藍R-250 興隆達公司；其他試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設備

FJ-200高速分散均質機 上海標本模型廠；pH計德國Sartorius公司；恒溫水浴鍋 德國Memmert公司；ATN-300全自動凱氏定氮儀 上海洪紀設備有限公司；Alpha 1-4 LDplus冷凍干燥機 德國Christ公司；Avanti J-26S XP大型臺式高速冷凍離心機 美國Beckman公司；凝膠成像儀 英國Syngen公司；Lambda紫外分光光度計 美國Perkin Elmer公司；FP-8200熒光分光光度計日本Jasco公司；1260超高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 堿法提取藍圓鲹分離蛋白

參考孫樂常等[12]的方法，在4 ℃環境下進行。將藍圓鲹去頭、去內臟和去皮之后，收集肌肉部分，與8 倍體積的冰水混合，并組織搗碎。用1 mol/L NaOH溶液調節pH 11.0，用玻璃棒攪拌10 min，使魚肉充分溶解。將提取液8 000×g離心10 min，小心收集上清液部分，用1 mol/L HCl溶液調節pH 5.5，持續攪拌10 min后，8 000×g離心10 min，收集沉淀部分。得到的沉淀部分用1 mol/L NaOH溶液調節pH 7.0即為藍圓鲹分離蛋白，并貯存于4 ℃，48 h內用于以下實驗。

1.3.2 藍圓鲹分離蛋白酶解

配制0.25 g/mL的藍圓鲹分離蛋白溶液，采用堿性蛋白酶酶解。酶解條件：pH 8.0，加酶量（占蛋白質量計）25 U/g，水解溫度50 ℃。反應體系用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液維持恒定pH 8.0。水解結束時，將酶解液在8 000×g、4 ℃離心15 min，收集上清液部分，進行冷凍干燥，即可得到藍圓鲹分離蛋白的酶解產物。

1.3.3 DH的測定

參照Church等[13]的方法，用OPA法測定水解樣品的DH。酶解產物用蒸餾水稀釋至終質量濃度為5 mg/mL。將100 μL樣品與750 μL OPA試劑混合，并在室溫下反應2 min，而后在340 nm波長處測量其吸光度。樣品的DH計算如式（1）所示：

式中：At為樣品在340 nm波長處的吸光度；A0為空白對照（水）在340 nm波長處的吸光度；M為蛋白質量/g；ε為340 nm的摩爾消光系數（6 000 L/（mol·cm）；N為稀釋因數；C為蛋白質量濃度/（g/L）。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

根據Laemmli[14]的方法略有修改，濃縮膠和分離膠丙烯酰胺凝膠分別為4%和15%。電泳后用考馬斯亮藍染色法染色，用脫色液脫色后。全蛋白SDS-PAGE樣品制備參考孫樂常等[12]的方法，將蛋白樣品液與蛋白溶解液（20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、1% SDS、8 mol/L尿素、2% β-巰基乙醇）以1∶2比例充分混合，95 ℃加熱20 min。利用Lowry法對樣品進行蛋白含量測定，調節樣品的上樣量為每泳道10 μg蛋白。

1.3.5 酶解產物的分子質量分布分析

參考Zhong Chan等[15]的高效液相色譜方法，將樣品上樣于TSK-gel G 2000 SWXL色譜柱。色譜條件為：進樣體積1 μL，流動相為0.1 mmol/L Na2SO4的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.7），洗脫流速0.5 mL/min，紫外檢測波長230 nm。標準分子質量參照為：L-半胱氨酸（240 Da）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（hippuryl-histidylleucine，HHL）（430 Da）、神經降壓素（1 673 Da）、本實驗室合成的肽IACGNW（6 640 Da）和小清蛋白（11 950 Da）。使用GPC軟件對所得色譜圖進行分子質量分布分析。

1.3.6 表面疏水性測定

采用熒光探針劑ANS法[16]，具體步驟為：用pH 7.0、10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液將不同DH的酶解產物稀釋至0.025～0.1 mg/L。將2 mL樣品液加入20 μL 8 mmol/L ANS溶液混勻，于黑暗中反應20 min，測定熒光強度。測試所用激發波長和發射波長分別為390 nm和470 nm，狹縫寬度為10 nm。

1.3.7 溶解性的測定

參考Latorres等[17]方法。稱取200 mg魚蛋白水解物樣品，將其溶解在20 mL蒸餾水中，用1 mmol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液調節樣品pH值至2.0、4.0、6.0、8.0與10.0?；旌衔?0 ℃、100 r/min轉速攪拌30 min，然后7 500×g離心15 min。上清液和樣品蛋白質含量按照Lowry法測定。樣品總蛋白質含量用0.5 mmol/L NaOH溶液溶解后樣品蛋白含量表示。蛋白質溶解度計算如式（2）所示：

1.3.8 乳化性與乳化穩定性分析

蛋白乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性指數（emulsion stability index，ESI）的測定參照Xu Xingfeng等[9]方法，并做一定改進。取0.15 g分離蛋白放入50 mL燒杯中，加入15 mL蒸餾水和5 mL葵花仁油，渦旋混勻，用1 mol/L HCl或1 mmol/L NaOH溶液將樣品pH值分別調節至2.0、4.0、6.0、8.0與10.0，隨后在20 000 r/min條件下高速分散1 min。分別在均質后0、10 min從離心管底部取50 μL乳狀液，加入5 mL 0.1% SDS溶液，渦旋10 s，隨后在500 nm波長處測定吸光度。EAI、ESI計算如式（3）、（4）所示：

式中：A0為0 min時吸光度；T為濁度（2.303）；DF為稀釋倍數；ρ為蛋白質量濃度/（g/mL）；φ為油在乳狀液中的比例（0.25）；At為放置10 min后吸光度；Δt為時間差/min。

1.3.9 起泡性與起泡穩定性分析

根據Agyare等[18]方法測定。配制50 mL 1 g/100 mL的蛋白液，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液分別調pH值至2.0、4.0、6.0、7.0、10.0，放入250 mL的燒杯中，將蛋白懸浮液用高速分散器以10 000 r/min速率攪打1 min，記錄攪打前后的體積。起泡能力用體積增加的百分比表示。隨后，將攪打起泡的樣品靜置10 min，記錄不同時間段的泡沫體積，其中所有實驗平行測量3 次。計算如式（5）、（6）所示：

式中：V1為攪打前的體積/mL；V2為攪打后的體積/mL；V3為攪打后靜置10 min的體積/mL。

1.3.10 持油力的測定

參考陳志軍等[19]的方法。準確稱取分離蛋白水解物0.5 g，并分別置于原質量m1的50 mL離心管中，加入10 mL的葵花籽油，混勻，靜置30 min，2 800×g離心30 min，小心去除分離的油層后，稱量離心管總質量m2，平行測定3 次，求取平均值。持油力計算如式（7）所示：

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 藍圓鲹分離蛋白DH與蛋白回收率

圖1 酶解時間對藍圓鲹分離蛋白DH和蛋白回收率的影響Fig. 1 Effect of hydrolysis time on DH and protein recovery

由圖1可知，在堿性蛋白酶作用下藍圓鲹分離蛋白的DH和蛋白回收率隨著反應時間的延長而增加。在前120 min，分離蛋白DH增幅較大，而隨后的DH增幅逐漸減緩。當反應到180 min后，DH與蛋白回收率幾乎沒有變化，第180分鐘時DH和蛋白回收率分別為21.51%和51.21%，這可能是因為酶解過程中產生的產物抑制效應、酶的熱失活以及特異性酶解位點的減少等因素的共同影響所導致。這與Xia Yichen等[20]在酶解大麥谷蛋白中DH和蛋白溶解性隨時間變化的趨勢一致。

2.2 SDS-PAGE分析

根據圖1的水解曲線，選取DH為5%、10%、15%與20%的樣品（分別記為DH5、DH10、DH15、DH20），對全蛋白與酶解上清液中蛋白進行SDS-PAGE分析，并與未酶解的分離蛋白進行比較，結果如圖2所示。酶解蛋白上清液中（圖2A），僅DH5的樣品中可觀察到組分中10～20 kDa之間蛋白條帶，其后的酶解樣品上清液中均無明顯的蛋白條帶，推測其上清液中主要組成可能為寡肽類小分子物質。對酶解樣品的全蛋白（圖2B）進行分析，發現隨著酶解進行，藍圓鲹分離蛋白中的肌球蛋白重鏈與肌動蛋白發生強烈降解，且產生的酶解產物主要集中在20～60 kDa范圍。其中，泳道2、3更高分子的蛋白條帶可能是伴肌動蛋白等肌原纖維蛋白中更大分子質量的蛋白。當DH為15%以上時，全蛋白組分中蛋白主要為15 kDa以下的小分子蛋白。結合圖2A（上清液）與圖2B（全蛋白）的蛋白分布情況，可知隨著酶解時間的延長，依舊存在部分不溶解的蛋白組分，其分子質量分布于10～30 kDa之間，推測其可能是酶解過程中釋放出來的疏水性較強的多肽片段，這與圖1中蛋白溶解度的結果一致。劉書來等[21]分別利用3 種蛋白酶（使用量為250～500 U/g）對鰱魚肌原纖維蛋白進行限制性酶解，發現DH為5%時，其肌原纖維蛋白的降解條帶主要集中在20～30 kDa范圍，這與本實驗的結果基本一致。由于未酶解分離蛋白的溶解性較低（圖1），因此在之后實驗中主要對不同DH的酶解上清液組分（以下簡稱酶解產物）進行比較分析。

圖2 藍圓鲹分離蛋白酶解產物SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE profiles of protein isolate of blue round scads and its hydrolysates at different DHs

2.3 藍圓鲹分離蛋白酶解產物的分子質量分布

圖3 不同DH酶解產物的分子質量分布Fig. 3 Molecular mass distribution of blue round scad protein isolate hydrolysates at different DHs

由圖3可知，隨著水解反應的進行，大分子的多肽逐漸被分解成大小不一的寡肽。DH為5%時，大于30 kDa有2.61%，10～30 kDa有16.1%。DH為10%時，5～10 kDa有9.4%，3～5 kDa有14.8%。當DH在15%以上，分子質量小于3 kDa的組分所占比例增大，分別為91.8%和96.8%，這與圖2中酶解產物的電泳圖結果一致。Morales-Medina等[22]利用枯草芽孢桿菌蛋白酶對沙丁魚和馬鮫魚肌肉蛋白進行酶解時，也發現類似的現象。

2.4 表面疏水性分析

圖4 不同DH酶解產物的表面疏水性Fig. 4 Surface hydrophobicity of blue round scad protein isolate hydrolysates at different DHs

如圖4所示，與分離蛋白（全蛋白）相比，酶解產物的表面疏水性隨DH的增加呈先上升后下降的趨勢，其中DH為5%時酶解產物所呈現的表面疏水性最高，其后則逐漸降低。這說明適度的酶解有助于將原本埋藏在蛋白內部的疏水基團暴露在溶液當中，進而使其表現出更高的疏水性[23]。而隨著水解的進一步進行，釋放出的肽段進一步通過離子鍵或氫鍵作用與大分子蛋白結合，并掩蓋蛋白表面的疏水氨基酸殘基，進而使其整體的表面疏水性降低[24]。這與Liu Yongle等[25]在堿性蛋白酶酶解魚糜的結果一致。

2.5 pH值對酶解產物溶解度的影響

圖5 pH值對不同DH藍圓鲹分離蛋白酶解產物溶解度的影響Fig. 5 Solubility of blue round scad protein isolate hydrolysates at different DHs as influenced by pH

如圖5所示，酶解產物的溶解度隨著DH的增加而增加，且在pH 2.0、7.0以及10.0溶解度均具有較好的溶解性，溶解度達80%以上。當DH為20%，pH 10.0時，酶解產物的溶解度達到最大值（（98.3±1.45）%）。當溶液pH 4.0時，所有酶解產物的溶解度均達到最低值，推測該pH值接近酶解產物的等電點，此時蛋白之間的分子作用力減小，容易發生聚集，從而導致溶解度降低[26]。與其他DH相比，DH20的酶解產物具有更高的溶解度，表明酶解能進一步將原本因疏水而易絮凝沉淀的蛋白分解成更小分子肽段，使其溶解于水相中，進而提高了酶解產物的溶解性[22]。

2.6 乳化性與乳化穩定性分析

表1 pH值對藍圓鲹分離蛋白酶解產物乳化性質的影響Table 1 Effect of pH on emulsifying properties of blue round scad protein isolate hydrolysates

如表1所示，與未酶解分離蛋白上清液組分相比，酶解產物在不同pH值條件下的EAI均得到不同程度的提升（pH 4.0除外）。但隨著DH的增加，EAI呈現逐漸下降趨勢。其中，DH為5%時EAI最高，在pH 10.0有最高的EAI為（100.87±0.65）m2/g，為未酶解對照組的5 倍以上。此外，DH15與DH20組的EAI與ESI明顯低于DH5與DH10。酶解產物的分子質量對乳化性質具有重要影響。一定的DH范圍內，蛋白分子質量的減少有利于提升表面疏水性與溶解性。此外，酶解過程中釋放的肽段也會增強蛋白分子間的電荷作用，有助于在一定程度上提高蛋白的乳化性[21]。而過度水解則會導致蛋白的肽鏈變短，無法在乳液油滴界面上形成黏彈性的膜，從而使其乳化性降低[27]。所有樣品在pH 4.0時EAI和ESI均為最小值，這是由于pH 4.0接近酶解產物的等電點，酶解產物中各蛋白片段的表面電荷減小，分子間相互作用減弱，進而導致乳化性下降[17]。相對地，當pH 10.0時所有的酶解產物EAI最高，這可能是由于在堿性條件下，酶解產物分子表面電荷增強，會誘導蛋白展開，增強酶解產物的乳化性[27]。另一方面，當DH為5%，酶解產物具有相對較高的ESI，其中pH 7.0與pH 10.0的ESI明顯高于pH 4.0與pH 2.0。酶解產物的溶解性是決定蛋白功能特性的重要因素。在本實驗中，DH為5%時的酶解產物在pH 2.0與pH 4.0時的溶解度明顯低于pH 7.0與pH 10.0，這可能是其ESI較低的重要原因。

2.7 起泡性與起泡穩定性分析

如表2所示，隨著DH的增加，酶解產物的起泡性和起泡穩定性呈先上升后下降的趨勢，DH為5%的酶解產物的起泡性最大（（227.3±3.8）%），當DH增加到10%時，酶解產物的起泡性反而下降。這與陳志軍等[25]使用堿性蛋白酶和復合蛋白酶酶解魚糜加工副產物的結果一致。起泡性的增加是因為酶解使得蛋白的溶解度顯著增加，從而使更多的多肽能夠吸附到界面，有利于液膜的形成[28]。隨著酶解程度的增加，起泡性和起泡穩定性下降，這是因為過度水解破壞了蛋白的結構，對蛋白的起泡能力和起泡穩定性產生不利影響[16]。與表1結果相似，所有酶解產物在pH 4.0時的起泡性和起泡穩定性最差，這與酶解產物在接近等電點時溶解性降低有關[25]。劉書來等[21]采用胰蛋白酶、中性蛋白酶及復合酶對鰱魚肌原纖維蛋白進行限制性酶解，結果發現復合蛋白酶酶解40 min時，蛋白的起泡性達到最高值（110%），并認為酶解時所使用的蛋白酶與DH對酶解產物的蛋白功能特性具有重要影響。相比之下，本研究酶解產物具有更高的起泡性，這可能與酶解蛋白的不同有關。本研究中酶解蛋白為分離蛋白，其不僅含有肌原纖維蛋白，還包含了較高含量的水溶性蛋白，因此在蛋白的整體溶解性上優于單純肌原纖維蛋白樣品。

表2 pH值對不同DH藍圓鲹分離蛋白酶解產物起泡特性的影響Table 2 Foaming properties of blue round scad protein isolate hydrolysates at different DHs as influenced by pH

2.8 持油力分析

圖6 不同DH酶解產物的持油力Fig. 6 Oil-holding capacity of blue round scad protein isolate hydrolysates at different DHs

由圖6可知，蛋白經酶解后，持油力先提高后降低，DH在15%以下時，持油力為3.00 g/g（油/蛋白）以上，其中，DH5的持油力最高，達3.50 g/g。而當DH為20%時，持油力僅為1.20 g/g。蛋白對油脂的吸附力與其表面疏水性以及暴露在蛋白表面的氨基酸殘基側鏈的非極性基團有關[29]。在本研究中，適度的酶解能有效增強分離蛋白的表面疏水性（圖1）與蛋白的溶解性（圖2），使得蛋白與油脂的接觸率與親和力提高，故而其持油力顯著提升。值得一提的是，蛋白的持油力是一種物理阻隔作用，過度的酶解則會導致酶解產物全部轉化為較小的小肽和游離氨基酸，無法有效阻隔油脂，因此導致持油力下降[30]。

3 結 論

本實驗利用堿性蛋白酶對藍圓鲹分離蛋白進行酶解，研究不同DH藍圓鲹分離蛋白酶解產物的功能性質。結果表明，通過限制酶解可以顯著提高分離蛋白的溶解性、乳化性、起泡性及持油力等功能性，其中DH為5%時酶解產物的蛋白功能性最佳，但繼續增加DH，蛋白功能性反而呈現逐漸下降趨勢，這說明酶解程度對開發利用藍圓鲹分離蛋白有關鍵影響。本研究酶解產物DH5在pH 2.0、pH 7.0以及pH 10.0均具有較好的起泡性與溶解性，表明其在未來蛋白飲料方面具有良好應用前景。此外，酶解產物還具有良好持油力，也表明其可以應用于肉糜制品的油脂乳化之中。綜上所述，本研究結果可為藍圓鲹分離蛋白在食品配料蛋白中的應用提供一定的理論參考。