缺氧外泌體傳遞miR-199a-5p 對胃癌細胞SGC-7901遷移和侵襲的影響

周 輝，沈偉鋒，邵平揚

（嘉興市第一醫院檢驗科，浙江 嘉興 314001）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為19～25 個核苷酸的單鏈非編碼RNA，能夠通過與靶基因的3′端非翻譯區（3′-UTR）特異結合，促進目標mRNA 降解或抑制其翻譯。miRNA 能夠調節細胞中約30%的mRNA 的表達，在細胞分化、增值和凋亡等各種生物學過程中發揮重要作用[1]。研究發現[2]，許多miRNA 與癌癥的發生發展密切相關，在細胞內發揮了促癌或者抑癌的作用。外泌體是由細胞內吞泡膜向內凹陷形成的多泡小體與細胞膜融合后釋放到細胞外的小囊泡，直徑為30～150 nm，廣泛存在于各種體液中[3，4]。在腫瘤微環境中，通過外泌體傳遞蛋白質、脂質、mRNA 和miRNA 等物質是除了分泌細胞因子、趨化因子和生長因子等可溶性介質外細胞間通訊的重要方式[5，6]。胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，根據世界衛生組織報告[7]，胃癌是全球發病率第5 高、致死率第3 高的癌癥，2018 年全球新發胃癌病例超過100 萬例，同時因胃癌致死病例超過78.3 萬例。中國是胃癌高發國家，其發病率和致死率均僅次于肺癌[8]。淋巴結轉移是胃癌最常見的轉移形式，其發生率隨腫瘤浸潤深度的增加而提高[9]。淋巴結轉移陽性胃癌患者5 年無復發生存率僅為53%[10，11]。缺氧是包括胃癌在內所有實體瘤一種普遍和持續存在的共同特征，對腫瘤的發生發展起著至關重要的作用[12]。缺氧不但能夠促進胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，還會促進胃癌細胞上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）和對化療藥物耐受[13-15]。本研究通過分析缺氧誘導的SGC-7901 胃癌細胞系來源的外泌體傳遞miRNA 對常氧胃癌細胞的作用，揭示外泌體在缺氧微環境中對胃癌侵襲和轉移的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 人胃腺癌細胞系SGC-7901（中國科學院上海細胞庫）；RPMI-1640 培養基（Hyclone）；胎 牛 血 清（fetal bovineserum，FBS）（Hyclone）；無外泌體培養基Exo-clearTM Complete Growth Medium（SBI）；外泌體提取試劑ExoQuick-TCTM Exosome Precipitation Solution（SBI）；Celltracker CM-DiI 活細胞示蹤劑（上海翊圣）；miR-199a-5p 類似物（miR-199a-5p mimics） 和miR-199a-5p 類似物陰性對照（miR-199a-5p mimicsNC）（委托上海吉瑪生物公司合成）；lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）；JEM-1230 透射電子顯微鏡（JEOL）；3311 型CO2細胞培養箱（Thermo Fisher）；CKX41 光學倒置顯微鏡（Olympus）、NanoDrop超微量分光光度儀（Thermo Fisher）、StepOne Plus 熒光定量PCR 儀（ABI）；G:BOX 系列智能熒光、化學發光成像系統（Syngene）、垂直電泳儀（BIO-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和缺氧誘導 SGC-7901 細胞置于含10% FBS、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的RPMI-1640 培養基中，在37℃、5%CO2的培養箱中傳代培養。取對數生長期的細胞使用無外泌體培養基培養24 h 后用于后續實驗。使用含200 μmol/L CoCl2的無外泌體培養基培養細胞模擬細胞缺氧，以不含CoCl2的無外泌體培養基為對照。

1.2.2 外泌體的提取 SGC-7901 細胞分別在常氧（Normoxia）和缺氧（Hypoxia）條件下培養24 h，收集細胞培養液。細胞培養液3000 g 離心15 min 去除細胞及細胞碎片。轉移上清液至無菌離心管，加入上清液1/5 體積的外泌體提取液，混勻后4 ℃靜置過夜。1500 g 離心30 min，棄上清；1500 g 離心5 min去除殘余液體。使用PBS 緩沖液重懸外泌體，BCA法測定蛋白濃度，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 透射電子顯微術分析 取10 μl 外泌體樣品于蠟盤上。取銅網使有支持膜的表面與樣品液表面接觸，靜置5 min 取出銅網，用濾紙條吸除多余的液滴，稍晾干。取3%磷鎢酸溶液，滴于臘盤上。吸附有樣品的銅網放置于染液表面（樣品與染液接觸），靜置5 min。取出銅網，用濾紙條吸除多余的液滴，白熾燈下晾干。使用透射電子顯微鏡觀察外泌體形態并拍照。

1.2.4 Western 免疫印記 使用RIPA 裂解液提取外泌體總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。取30 μg 提取的總蛋白，經15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）至溴酚藍遷移至分離膠下緣后轉膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入1∶1000 稀釋的兔抗人CD9、CD63 單克隆抗體，4℃搖床上孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶10000）室溫孵育1 h，ECL 化學發光試劑顯色，凝膠成像分析儀中化學光敏模式曝光顯影。

1.2.5 劃痕實驗 通過體外劃痕實驗檢測細胞的遷移能力[16]。細胞消化后接種至6 孔板，培養24 h 至細胞鋪滿板底后，用200 μl 槍頭垂直于孔板制造細胞劃痕。吸去細胞培養液，用PBS 沖洗孔板3 次以洗去劃痕產生的細胞碎片。加入無血清培養基，拍照記錄。將培養板放入培養箱培養，24 h 后取出拍照，根據收集圖片數據分析實驗結果。劃痕閉合率（%）=細胞遷移后的表面積/總表面積×100。

1.2.6 侵襲實驗 使用Matrigel 包被Transwell 小室，細胞消化后使用含0.5% FBS 的RPMI-1640 培養基稀釋細胞并接種于上室，下室加入400 μl 含10%FBS 的RPMI-1640 培養基。16 h 后刮去上室細胞，使用甲醛水溶液固定30 min 后結晶紫染色20 min，顯微鏡下拍照，使用ImageJ 軟件統計遷移到膜下的細胞數。

1.2.7 miRNA 測序和生物信息學分析 正常和缺氧外泌體miRNA 文庫構建、序列測定和生物信息學分析由廣州吉賽生物完成。使用STAR 對讀取的數據繪制基因組，miRdeep 用于計算miRNA 的表達[17]。采用TMM（trimmed mean of M-values）方法對測序片段計數矩陣進行標準化處理。用edgeR 程序鑒定差異表達基因，表達差異超過1.5 倍且P＜0.05 的miRNA 認為是差異表達。

1.2.8 實時熒光定量PCR 根據miRNA miRNeasy Micro Kit 操作說明分別提取缺氧和常氧細胞外泌體RNA，并使用實時熒光逆轉錄定量PCR（realtime quantitative reverse transcription -polymerase chain reaction，real-time qRT-PCR）測定miR-199a-5p 的表達量，使用GAPDH 作為內參。

1.2.9 miR-199a-5p 類似物轉染 使用lipofectamine 2000 把miR-199a-5pmimics 或miR-199a-5p mimicsNC 導入SGC-7901 細胞中以提高細胞內miR-199a-5p 水平，轉染濃度為50 nmol/L。

1.3 統計學方法 應用SPSS 26.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以（）表示，采用t檢驗；以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外泌體形態觀察 透射電子顯微鏡下顯示，常氧和缺氧SGC-7901 細胞分泌的外泌體均呈圓形或橢圓形的杯狀結構，直徑為50～150 nm，多個視野對比外泌體形態未見明顯差異，見圖1。

2.2 外泌體標志物檢測 常氧和缺氧SGC-7901 細胞分泌外泌體進行Western 印記分析，結果顯示兩組外泌體均表達CD63 和Tsg101 蛋白標志物，見圖2。

2.3 缺氧腫瘤細胞來源的外泌體對常氧腫瘤細胞的遷移和侵襲的影響 劃痕實驗顯示，缺氧處理SGC-7901 細胞分泌的外泌體共培養的常氧SGC-7901細胞劃痕閉合率高于常氧SGC-7901 細胞分泌的外泌體共培養的常氧SGC-7901 細胞（P＜0.05），見圖3A。侵襲實驗顯示，缺氧處理SGC-7901 細胞分泌的外泌體共培養的常氧SGC-7901 細胞移動到transwell 小室下方的數量高于常氧SGC-7901 細胞分泌的外泌體共培養的常氧SGC-7901 細胞數量（P＜0.05），見圖3B。

圖1 常氧和缺氧條件下SGC-7901 細胞源性外泌體的電鏡特點（×50000）

圖2 常氧和缺氧SGC-7901 細胞分泌外泌體CD63和Tsg101 蛋白標志物表達情況

圖3 缺氧腫瘤細胞來源外泌體對常氧腫瘤細胞遷移和侵襲的影響

2.4 缺氧外泌體miRNA 的表達情況 測序和RTPCR 研究顯示，缺氧外泌體中miR-199a-5p 的表達高于常氧外泌體（P＜0.05），見圖4。

2.5 缺氧外泌體傳遞miR-199a-5p 對常氧胃癌細胞侵襲和轉移的影響 為了分析缺氧SGC-7901 細胞源性外泌體是否通過傳遞miR-199a-5p 促進常氧SGC-7901 細胞侵襲和轉移，將miR-199a-5p mimics 和miR-a99a-5p NC 分別導入缺氧培養的SGC-7901 細胞，提取外泌體與常氧SGC-7901 細胞共培養。劃痕實驗顯示，導入miR-199a-5p mimics 細胞來源的外泌體共培養的常氧SGC-7901 細胞劃痕閉合率高于導入miR-199a-5p mimicsNC 細胞來源的外泌體共培養的常氧SGC-7901 細胞（P＜0.05），見圖5A。侵襲實驗顯示，導入miR-199a-5p mimics 細胞來源的外泌體共培養的常氧SGC-7901 細胞移動到transwell 小室下方的數量高于導入miR-199a-5p mimicsNC 細胞來源的外泌體共培養的常氧SGC-7901 細胞（P＜0.05），見圖5B。

圖4 缺氧外泌體miRNA 的表達情況

圖5 缺氧腫瘤細胞來源外泌體傳遞miR-199a-5p 對常氧腫瘤細胞的遷移和侵襲的影響

3 討論

外泌體由細胞分泌釋放，在血液等循環系統內傳播，最后可被其他細胞吞噬，是細胞間通訊的重要介質[18]。外泌體可以介導長距離細胞間通訊而無需細胞間接觸，加上納米大小的尺寸和生物相容性的特性使其成為潛在的藥物載體受到臨床廣泛關注[19]。缺氧是由于腫瘤細胞快速增殖造成大量氧氣被消耗，且腫瘤內部往往因血管生成異常等原因導致氧氣供應不足，使得腫瘤細胞處于缺氧的微環境中[20，21]。多項研究發現[22-24]，缺氧可通過多種方式影響腫瘤的生物學行為，如加速腫瘤的擴散和惡性進展，調控癌細胞的分化，選擇性抵抗凋亡和促進化療耐藥等，特別是在腫瘤的轉移過程中，從EMT 到器官親和性轉移，缺氧都起到了重要的調節作用[25]。在胃癌中，缺氧也發揮了重要的促癌作用，其不但能夠促進胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，還會促進胃癌細胞EMT 和對化療藥物耐受[13-15]。

本研究使用外泌體提取試劑分別提取了常氧和缺氧SGC-7901 細胞分泌的外泌體，透射電鏡結果發現，兩種培養條件的細胞分泌的外泌體均呈直徑為50～150 nm 圓形或橢圓形的杯狀結構，表明缺氧環境沒有改變SGC-7901 細胞分泌的外泌體的大小和形態。Western 印記驗證了常氧和缺氧外泌體均表達已知的外泌體蛋白標志物CD63 和Tsg101。為了分析缺氧胃癌細胞分泌的外泌體在腫瘤微環境中的作用，本研究使用含CoCl2的無外泌體培養基培養SGC-7901 細胞模擬細胞缺氧，提取外泌體后與常氧SGC-7901 細胞共培養，劃痕和侵襲實驗顯示，缺氧SGC-7901 細胞來源外泌體能夠促進常氧SGC-7901 細胞遷移和侵襲。

近些年，外泌體介導miRNA 在細胞間通訊中的作用尤其受到關注，因miRNA 可以通過調控靶基因的表達調節一系列病理生理反應。研究發現[26]，來自腫瘤細胞的外泌體中的miRNA 能夠通過重塑腫瘤微環境來支持腫瘤的生長。Hsieh CH 等[27]研究發現，頭頸部鱗狀細胞癌細胞外泌體來源的miR-21 增加了腫瘤相關巨噬細胞的M2 樣極化。另有研究發現[28]，缺氧微環境與腫瘤細胞分泌的外泌體miRNA 變化密切相關。Wang X 等[29]研究發現，缺氧腫瘤源性miR-301a 通過調控PTEN/PI3Kγ 介導M2 巨噬細胞極化促進胰腺癌轉移，且缺氧使肺癌細胞分泌外泌體中miR-103a 水平升高，從而增強腫瘤血管生成和血管通透性，最終導致腫瘤轉移。然而，外泌體miRNA 改變與胃癌進展過程中缺氧之間關系的作用和機制尚未被詳細揭示。本研究利用測序和RTPCR 發現，缺氧外泌體中miR-199a-5p 的表達高于常氧外泌體，為了進一步分析缺氧SGC-7901 細胞源性外泌體是否通過傳遞miR-199a-5p 促進常氧SGC-7901 細胞侵襲和轉移，本研究將miR-199a-5p mimics 導入缺氧培養的SGC-7901 細胞，劃痕和侵襲實驗顯示，缺氧SGC-7901 細胞來源外泌體能夠傳遞miR-199a-5p 促進常氧SGC-7901 細胞遷移和侵襲。

綜上所述，缺氧微環境可能會刺激胃癌細胞產生富含miR-199a-5p 的外泌體，并將其輸送至周圍常氧胃癌細胞以促進其遷移和侵襲。