光譜技術分析尿素對BSA糖基化反應的影響

李 雪，王 麗，劉光憲*，涂宗財

1.江西省農業科學院農產品加工研究所，江西 南昌 330200 2.江西師范大學生命科學學院，江西 南昌 330022

引 言

蛋白質的結構展開與其糖基化反應之間存在較大的相關性，可以促進蛋白質結構展開的有化學試劑[1-2](尿素、二硫蘇糖醇等)、超聲波[3]、動態高壓微射流[4]等，Yang等[3]研究發現高強度超聲波可以促進卵清蛋白結構的去折疊，提高糖基化反應程度；Zhong等[4]研究發現動態高壓微射流在80 MPa以下時會使β-乳球蛋白結構展開；Huang等[2]研究發現二硫蘇糖醇可使卵白蛋白的二硫鍵斷裂，蛋白質結構展開，糖基化位點從7個增加至12個。但是尚未見研究尿素對牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)糖基化產物影響的報道。

由于大部分蛋白質都具有熒光特性，在外力作用或與其他物質作用后，其熒光特性和高級結構可能發生改變。Tang等[5]采用光譜技術測定了不同條件下云扁豆蛋白與葡糖糖反應的結構和理化性質的變化；Anjana Roy等[6]通過熒光光譜和圓二光譜分析了葡糖糖修飾血紅素蛋白前后的二級和三級結構變化；Zhong等[7]采用紫外分析和內源熒光光譜分析法，研究了動態高壓微射流對β-乳球蛋白與低聚半乳糖糖基化反應前后構象的變化，因此，可以運用蛋白質的光譜學特性分析不同尿素濃度對蛋白質糖基化產物的影響。

血清白蛋白是脊椎動物的血漿和血清中含量最高的一種可溶于水的大分子蛋白[8]，含量高達40 mg·mL-1，約占血漿中總蛋白的52%～62%，具有維持血液滲透壓、調節血液pH及轉運脂肪酸、氨基酸、金屬離子、類固醇、藥物等多種物質的生理功能[9-10]。其中，BSA是牛血液和牛奶中常見的一種球狀蛋白，其序列與人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)具有76%的同源性，是由583個氨基酸殘基組成的單肽鏈，是一種常用的模式蛋白，可作為動物來源的代表蛋白[11]。故本文選用BSA為模式蛋白，開展相關研究可為其他動物蛋白的糖基化改性提供理論參考。尿素常作為非蛋白氮原料添加至動物飼料中，因此，本研究的開展可為探索尿素對動物體內甚至是人體內新陳代謝的影響提供理論支撐。

首先采用不同濃度尿素誘導BSA結構發生不同程度的展開，再與葡萄糖進行糖基化反應，基于三維熒光光譜、同步熒光光譜、內源熒光光譜和紫外光譜技術分析不同濃度尿素誘導對BSA糖基化反應產物空間結構的影響，揭示尿素對BSA糖基化的作用規律，為基于尿素導致的蛋白質結構展開對蛋白質糖基化反應的影響提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑及儀器

BSA、D-葡萄糖均購于Sigma化學試劑公司；尿素、Tris-HCl均為國產分純。

U-2910紫外光譜掃描儀，日本HITACHI公司；F-7000熒光光譜掃描儀，日本HITACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

用pH為7.4濃度為0.05 mol·L-1的Tris-HCl溶液配置成100 mg·mL-1的BSA溶液，用同濃度的Tris-HCl溶液配置尿素溶液，濃度分別為0，1，2，3，4，5，6和7 mol·L-1，尿素濃度0 mol·L-1為本實驗對照組；在15 mL的離心管中加入0.1 mL BSA溶液，將不同濃度尿素溶液等體積分別加入離心管混合均勻，37 ℃水浴2 h后加入與蛋白質量比為1∶1的葡萄糖，60 ℃水浴3 h，樣品制備完成，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 自由氨基的測定

采用鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde，OPA)法測定BSA糖基化產物中自由氨基的含量，OPA試劑的配制方法參照文獻[12]。取200 μL樣品溶液，加入配好的OPA試劑溶液4.0 mL，混勻，35 ℃避光反應2 min，于340 nm處測定其吸光值，空白采用200 μL蒸餾水。以賴氨酸做標準工作曲線，然后根據標準曲線計算樣品中自由氨基的含量。

1.2.3 內源熒光光譜分析

對不同濃度尿素處理的BSA糖基化樣品溶液(1 mg·mL-1)進行內源熒光光譜分析。內源熒光參數設置：激發波長為280 nm，發射光譜掃描范圍為300～500 nm，掃描速度為240 nm·min-1，激發和發射的狹縫寬度均為5 nm。

1.2.4 同步熒光光譜分析

對不同濃度尿素處理的BSA糖基化樣品溶液(1 mg·mL-1)進行同步熒光熒光光譜分析。固定激發和發射波長的間隔為Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，在25 ℃下掃描同步熒光光譜。

1.2.5 紫外光譜分析

對不同濃度尿素處理的BSA糖基化樣品溶液(1 mg·mL-1)進行紫外掃描，掃描范圍為190～450 nm，掃描速度為200 nm·min-1，狹縫寬度為1.50 nm。

1.2.6 三維熒光光譜分析

對不同濃度尿素處理的BSA和3 mol·L-1尿素濃度處理的糖基化BSA樣品溶液(1 mg·mL-1)進行三維熒光熒光光譜分析。三維熒光分析的參數為激發波長掃描范圍：200～600 nm，發射波長掃描范圍：200～600 nm，掃描速率為12 000 nm·min-1，狹縫寬為5 nm。

2 結果與討論

2.1 自由氨基含量變化

BSA的糖基化反應是葡萄糖分子的羰基與蛋白質分子的氨基通過共價鍵相互交聯而形成的糖蛋白化學反應，因此BSA自由氨基含量的變化可以反映其糖基化程度。從圖1可以看出，經過不同濃度尿素處理的BSA，其糖基化產物的自由氨基含量均顯著下降。這說明尿素處理可使BSA分子的空間結構發生不同程度的伸展，使BSA分子中的氨基暴露在蛋白質分子表面，葡萄糖的羰基更易與BSA分子中的氨基發生共價交聯反應，促進了BSA與葡萄糖的糖基化反應。故經過尿素處理的BSA，其糖基化產物中的自由氨基含量均顯著下降。從圖1還可看出，在尿素濃度為3 mol·L-1時，BSA糖基化產物的自由氨基含量降至最低為8.75 mg·kg-1，糖基化程度達到最大。而高濃度尿素(4～7 mol·L-1)處理的BSA糖基化產物的自由氨基含量高于尿素濃度為3 mol·L-1時的自由氨基含量，可能是由于高濃度的尿素對BSA的糖基化反應形成了空間位阻，阻礙了葡萄糖分子與BSA分子的共價交聯。

圖1 不同濃度尿素處理的BSA糖基化產物的自由氨基含量分析Fig.1 The free amino group content of glycosylation of BSA treated with different concentrations of urea

2.2 內源熒光光譜分析

BSA的內源性熒光主要來自分子內部的色氨酸殘基(Trp)、酪氨酸殘基(Tyr)和苯丙氨酸殘基(Phe)，其中BSA分子中Trp殘基的熒光強度遠遠大于Tyr殘基和Phe殘基，因此可以用BSA分子中的Trp殘基作為內源熒光探針來分析不同尿素濃度對BSA糖基化產物內源性熒光強度的影響。

從圖2可以看出，尿素的加入使BSA糖基化產物的內源熒光強度顯著下降，且隨著尿素濃度的增加BSA糖基化產物的內源性熒光強度呈逐漸降低的趨勢。BSA有兩個色氨酸殘基Trp134和Trp213(如圖3所示)，其中Trp213位于BSA分子疏水腔內，而Trp134位于BSA分子表面[13]，因此引起BSA糖基化產物內源性熒光強度顯著下降的原因可能是由于尿素誘導后的BSA發生了去折疊，降低了Trp殘基之間的能量傳遞，導致BSA分子疏水腔內的Trp213外翻至分子表面，且隨著尿素濃度的增加，Trp213逐漸暴露于溶劑中，從而發生熒光猝滅，使得糖基化產物的內源性熒光強度顯著下降。從圖2還可以看出尿素濃度為1～4 mol·L-1時，BSA糖基化產物的最大發射波長發生了輕微的藍移(從340到336 nm)，這是由于BSA與葡萄糖糖發生糖基化反應后，Trp所處的微環境發生變化，疏水性增加，使得BSA糖基化產物的最大發射波長藍移。此外，與對照樣品對比，當尿素濃度大于4 mol·L-1，最大發射波長逐漸發生紅移，從336 nm紅移至340 nm，這可能是由于高濃度的尿素處理使得Trp殘基周圍環境的疏水性降低，親水性增加，BSA分子已經完全伸展變形，使Trp殘基完全暴露于溶劑中。

圖2 不同濃度尿素處理的BSA糖基化產物的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of glycosylation of BSA treated with different concentrations of ureaa→b：0，1，2，3，4，5，6，7 mol·L-1

圖3 BSA的空間結構圖Fig.3 The space structure of BSA

2.3 同步熒光光譜分析

蛋白質的同步熒光光譜已被廣泛用于研究蛋白質的結構變化，是一種快速、靈敏、無損的分析方法，可用來研究蛋白質分子中發色基團空間結構的變化以及周圍微環境的變化。由于內源熒光無法區分BSA分子中Trp殘基和Tyr殘基的熒光光譜，因此，采用同步熒光光譜法測定不同濃度尿素處理的BSA糖基化樣品空間結構的變化。Δλ=15 nm同步熒光光譜顯示BSA糖基化產物中Tyr殘基的光譜特征，Δλ=60 nm所得到的同步熒光光譜圖顯示BSA糖基化產物中Trp殘基的熒光光譜特征，其殘基的最大發射波長與BSA糖基化產物所處的環境極性有關，如果最大發射波長發生改變，說明殘基所處的微環境發生改變。圖4為不同濃度尿素處理對BSA糖基化產物同步熒光強度的影響。如圖4(a)所示，在BSA濃度固定在1 mg·mL-1時，隨著尿素濃度的增加，1～3 mol·L-1尿素濃度處理后BSA最大發射波長的強度高于未加尿素對照組，而4～7 mol·L-1的尿素濃度處理后的BSA最大發射波長的強度低于未加尿素對照組，且Tyr殘基的特征熒光光譜峰位置發生藍移，說明經過4～7 mol·L-1尿素處理之后的BSA糖基化產物的Tyr殘基所在的微環境發生改變，疏水性增加，親水性降低。對比圖4(a)和(b)可知，Trp殘基的熒光強度遠遠高于Tyr殘基的熒光強度，而且相比Tyr殘基的熒光強度，Trp殘基的熒光強度下降更為顯著，表明尿素與BSA的結合點更接近于Trp殘基，但同時Trp殘基的最大發射波長略有藍移，說明其附近的疏水性發生一定程度地增強，極性減小，疏水性增加，BSA分子發生去折疊，Trp殘基由分子內部展開至蛋白質表面。

圖4 不同濃度尿素處理的BSA糖基化產物的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectra after glycosylation of BSA in different urea treatments(a)：Δλ=15 nm,(a→b):1，2，3，0，4，5，6，7 mol·L-1;(b)：Δλ=60 nm，(a→b):0，1，2，3，4，5，6，7 mol·L-1

2.4 紫外光譜掃描分析

紫外掃描分析是一種簡單易行的分析蛋白質空間構象變化的方法[14]。BSA在紫外區(190～450 nm)有紫外吸收，這與BSA分子中的芳香族氨基酸Trp，Tyr和Phe具有密切的關系。因此，可采用紫外掃描的方法來研究不同濃度尿素處理對BSA糖基化產物空間結構的影響。由圖5可知，經尿素處理后的BSA糖基化產物的紫外吸收值均大于對照組，而且3 mol·L-1尿素濃度處理后的BSA糖基化產物的紫外吸收值均大于其他濃度，說明尿素的加入，在不同程度上打開了BSA的蛋白質分子結構，使BSA分子內部的芳香族氨基酸殘基暴露于蛋白質表面；也可能是尿素處理使蛋白質結構展開，從而有利于BSA與葡萄糖發生羰胺縮合反應，產生較多的糖基化產物羥甲基糠醛，其在278 nm附近也有紫外吸收[15]，且在3 mol·L-1的尿素濃度時最有利于糖基化產物的生成，此結果與上述自由氨基含量的測定結果一致。

圖5 不同濃度尿素處理BSA糖基化樣品的紫外掃描光譜Fig.5 Ultraviolet scanning spectra after glycosylation of BSA in different urea treatmentsa→b:3，4，5，7，6，2，1，0 mol·L-1

2.5 尿素對BSA三維熒光光譜的影響

從糖基化樣品(尿素添加量為3 mol·L-1)的三維熒光光譜圖(圖6)和表1分析可發現，糖基化后BSA的熒光峰Ex/Em出現在280/370，與未糖基化反應的BSA和3 mol·L-1尿素濃度處理的BSA相比，其三維熒光有顯著差異，最大發射波長發生了5和10 nm的藍移，該現象表明經過尿素處理的BSA糖基化產物的肽鏈骨架發生了空間構象變化，其高級結構發生改變，BSA環境的疏水性增加，極性減小，該結果與同步熒光的研究結果一致。

表1 典型三維熒光峰Table 1 Typical three-dimensional fluorescence peaks

圖6 不同濃度尿素處理的BSA和糖基化BSA產物的三維熒光光譜圖Fig.6 3D fluorescence spectra after glycosylation of BSA and BSA in different urea treatments

3 結 論

利用光譜技術來研究不同尿素濃度對BSA糖基化反應產物空間結構的影響，得到以下結論：

(1)通過內源熒光光譜分析可以看出，尿素的加入會使BSA分子去折疊從而促進蛋白質的糖基化反應，導致其糖基化產物的內源性熒光發生猝滅。

(2)通過同步熒光光譜分析得出BSA與尿素的結合點更接近于Trp殘基。

(3)通過自由氨基和紫外吸收光譜分析得出BSA分子在尿素的誘導下緊密的空間結構變得松散，芳香族氨基酸暴露至表面，可促進糖基化反應進行，且3 mol·L-1尿素濃度下最有利與糖基化產物的生成。

(4)通過三維熒光光譜分析得出隨著尿素濃度的增加，BSA的最大發射波長先紅移再藍移，經3 mol·L-1尿素誘導的BSA糖基化產物的肽鏈骨架的空間構象發生變化。