血清SARS-CoV-2特異性抗體檢測研究進展

王 維 綜述，周 取，劉文彬 審校

(1.重慶市第六人民醫院實驗醫學中心，重慶 400060；2.重慶大學附屬腫瘤醫院肝膽胰腫瘤科，重慶 400030)

國內最先將新型冠狀病毒(2019-nCoV)引起的下呼吸道感染稱作新型冠狀病毒性肺炎(NCP)，隨后世界衛生組織將NCP重新命名為COVID-19，2019-nCoV也被國際病毒分類學委員會改名為SARS-CoV-2[1]。截至2020年10月8日，SARS-CoV-2在全世界范圍內累積感染人數已超過3 000萬，感染所致死亡人數超過100萬人，波及100多個國家。COVID-19疫情的暴發也引起了研究者的關注，并迅速從人氣道上皮細胞內分離確定了病原體[2]。該病毒存在人與人之間傳播的高風險[3]。因此，及時對攜帶者或感染者進行診斷對控制疫情和疾病治療都至關重要。COVID-19患者常見的臨床癥狀包括發燒、咳嗽、肌痛或乏力，與其他病毒感染癥狀相似，臨床主要依賴于實驗室結果進行診斷。SARS-CoV-2核酸逆轉錄聚合酶鏈式反應測試已成為當前診斷COVID-19的主要方法，其具有靈敏度高、特異性好、可早期診斷等優勢[4-5]。研究顯示，SARS-CoV-2受體在肺泡上皮細胞表達最多，在氣道上皮細胞和內皮細胞等表達較低，因此肺泡灌洗液為最佳檢測標本，其次為痰液，而臨床最常見的檢測標本為咽拭子[6]，容易出現假陰性結果，影響疾病的診斷和治療。此外，SARS-CoV-2核酸檢測對實驗室生物安全要求較高，操作煩瑣且檢測時間長[7]，也增加了醫務人員職業暴露的風險。此外，核酸檢測還易受試劑檢測性能、人員技術等多方面影響[8]。因此，SARS-CoV-2核酸檢測不適用于對COVID-19的快速診斷和大規模疾病篩查，迫切需要其他實驗室指標來提高診斷效率。隨著對SARS-CoV-2的流行病學研究和診療經驗積累，SARS-CoV-2特異性抗體已經與核酸檢測、病毒基因測序列一起被列為COVID-19確診的病原學證據之一[9]。本文將綜述目前批準上市廠家的SARS-CoV-2抗體檢測試劑的檢測效能評估，為該檢測項目的開展和方法學選擇提供理論依據。

1 SARS-CoV-2抗體檢測的意義及現狀

在病毒感染后，宿主免疫系統將通過B淋巴細胞產生的血清學特異性抗體，與病原微生物表面的抗原結合，阻止與靶細胞受體結合侵入細胞。病毒入侵后1周左右開始產生免疫球蛋白M(IgM)，其濃度較低，持續時間短，是感染急性期較好的標志；IgG產生相對較晚，其濃度高，維持時間也長，是感染中、后期及既往感染的重要標志物[10-11]。因此，抗體檢測對于疾病的輔助診斷和分期都意義重大。目前血清學特異性抗體檢測作為感染性疾病的輔助診斷指標已運用廣泛，如艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、梅毒螺旋體等抗體的檢測。由于疫情進展迅速，急需提高診斷效率，國家食品藥品監督管理總局(CFDA)特為SARS-CoV-2相關診斷試劑提供綠色通道，應急審批了相關檢測產品，其中陸續有膠體金法、化學發光法的商品化抗體診斷試劑被批準上市，但是血清學特異性抗體作為確診指標的準確性還需要更多的臨床數據予以驗證。據CFDA官網顯示，截至2020年3月16日，CFDA共批準SARS-CoV-2抗體檢測試劑9個，包括6家膠體金免疫層析法和3家公司的化學發光法SARS-CoV-2特異性抗體檢測試劑盒，另還有諸如鄭州安圖生物工程有限公司、深圳亞輝龍生物科技有限公司等公司特異性抗體診斷產品已進入臨床驗證階段。

多數患者在核酸轉陰后抗體在一段時間內將持續存在，因此，抗體檢測對疫情的回顧性診斷和流行病學調查具有重要意義。SARS-CoV-2作為一種全新的病毒，其感染后IgM和IgG抗體的消長情況還鮮有報道。此外，SARS-CoV-2抗體檢測還可用于研究隱性攜帶者人群比例，無癥狀病毒攜帶者是否因體內產生抗體而無癥狀，不同臨床癥狀與機體產生抗體的關系和應用抗體陽性血漿治療重癥COVID-19患者的研究等[12]。

2 膠體金免疫層析技術檢測SARS-CoV-2抗體的研究現狀

膠體金免疫層析技術(膠體金法)是一種將膠體金標記技術、免疫檢測技術和層析分析技術等多種方法有機結合在一起的固相標記免疫檢測技術。其原理為標記物與待測物結合被相應的配體捕獲而濃集顯色，以纖維膜上顯色帶的有無進行定性檢測。經過30多年的發展，膠體金免疫層析技術的不斷成熟，不僅運用于激素、疾病相關蛋白、病原微生物抗原抗體、藥物濃度等的監測[13]，還被廣泛應用于電鏡水平研究、光顯微細胞化學、免疫沉淀及蛋白質染色技術上，并且被引進免疫診斷工業領域中，尤其是在生物醫學領域[14]。膠體金法以其操作簡便、加樣量少、特異性強、反應速度快和無須特殊儀器等優點而被廣泛應用，已成為目前進行快速診斷的主要方法之一。目前上市的膠體金法SARS-CoV-2血清學特異抗體檢測試劑盒可定性檢測人血清、血漿、全血樣本中SARS-CoV-2的IgM和IgG抗體。試劑盒操作簡單，15 min即可肉眼判讀結果，能在患者感染的第7天或發病的第3天檢測出lgM抗體，可更有效評估疑似病例，作為核酸檢測的補充或協同能夠突破現有檢測技術對場地和操作人員的限制。

由于COVID-19疫情突發且進展迅速，各廠家研發時間較短，現市場上的檢測試劑盒性能良莠不齊。梁穎等[15]對北京英諾特生物技術有限公司SARS-CoV-2膠體金檢測試劑盒進行了性能評估，發現在236例COVID-19確診組中，英諾特公司試劑檢測IgM靈敏度為73.31%，特異性為100.00%；檢測IgG靈敏度為85.59%，特異性為96.61%?？梢娫摴維ARS-CoV-2抗體檢測試劑總體符合率較好，其中IgG抗體檢測靈敏度高于IgM抗體，這可能與IgM本身存在時間短、含量低相關。梁穎等[15]也對北京英諾特和廣州萬孚生物技術有限公司膠體金法SARS-CoV-2抗體檢測試劑的檢測性能進行了比較，發現北京英諾特和廣州萬孚這2種檢測試劑的靈敏度、特異性、陽性預測值、陰性預測值和準確性等檢測效能指標無顯著差異。但廣州萬孚公司試劑只能檢測SARS-CoV-2總抗體，不能有效區分IgM和IgG，對于現癥感染和既往感染無法鑒別。此外，該研究還發現英諾特和萬孚公司在陰性照組中均檢出2例相同的抗體陽性標本。隨訪后發現該2例患者有糖尿病、高血壓等基礎疾病，長期服用藥物。提示對于有基礎疾病，長期服用藥物，或是存在自身免疫性疾病等患者，膠體金法的檢測抗體結果需結合其他確診指標進行綜合分析。

徐云云等[16]對北京熱景生物技術公司膠體金法SARS-CoV-2抗體檢測試劑進行性能驗證，發現該公司IgM抗體試劑靈敏度為81.25%(65/80)，特異性為96.00%(48/50)。但鄧杰倫等[17]同樣采用北京熱景公司膠體金法SARS-CoV-2抗體檢測試劑進行臨床檢測后發現IgM抗體試劑靈敏度僅為50.00%(16/32)，特異性為90.91%(40/44)，與徐云云等[16]的靈敏度驗證結果不同，差異有統計學意義(P=0.001 9)。導致兩篇研究結果不同的原因可能有以下幾個方面：(1)鄧杰倫等[17]對該試劑盒進行臨床驗證時標本數量較少，存在抽樣誤差；(2)檢測操作的影響，由于實驗室由多名工作人員操作，加樣量不統一，判定時間不統一，肉眼判斷也有一定的隨意性；(3)環境影響，如疫情發生在冬季，試劑性能受環境溫度影響大等。

總結上述CFDA批準的SARS-CoV-2膠體金法檢測抗體試劑盒的性能驗證結果(表1)并進行分析。因各公司試劑檢測的抗體種類存在差異，如北京英諾特公司可分別檢測IgM和IgG，北京熱景公司可檢測IgM和總抗體，而廣州萬孚公司只能檢測總抗體，故選擇了綜合指標(總抗體)對各試劑盒的診斷效能進行評估。分析后發現：(1)3家公司的SARS-CoV-2抗體檢測試劑特異性并無差異；(2)北京英諾特公司和廣州萬孚公司的SARS-CoV-2抗體檢測靈敏度明顯高于北京熱景公司，差異均有統計學意義(P=0.019 6、0.044 6)。見表2。但此次北京熱景公司統計樣本量少。北京英諾特公司和廣州萬孚公司的SARS-CoV-2抗體檢測靈敏度無差異。

總體來說，膠體金法檢測IgM、IgG和總抗體的靈敏度約為80%，難以避免假陰性結果產生，分析其原因可能有：(1)COVID-19患者體內抗體濃度低于試劑盒檢測下限；(2)COVID-19患者因個體免疫應答因素產生抗體障礙；(3)IgM抗體在感染后較快產生但卻在2周后開始減少并消失，而在進行測試時很難準確了解患者的感染時間，若測試時抗體已經消失可能無法檢測到。因此，應加強對膠體金法SARS-CoV-2抗體檢測試劑盒的研究與開發從而提高其診斷敏感性。從上述SARS-CoV-2抗體檢測試劑性能驗證數據中可見，各公司檢測試劑雖靈敏度存在差異，但特異性均較高，可與核酸特異性相近[18]，能滿足臨床要求[19]。

綜上所述，與核酸檢測相比，膠體金法檢測SARS-CoV-2抗體簡單快速，對設備硬件要求不高，可進行床邊檢測，也可在診所、實驗室、機場和火車站、基層醫院或野外等特定場合開展檢測。對于篩查無癥狀SARS-CoV-2攜帶者、疑似患者，具有重要的現實意義。此外，膠體金法檢測SARS-CoV-2抗體的另一潛在應用是篩查無癥狀SARS-CoV-2攜帶者，這對控制COVID-19疫情的傳播至關重要。然而，膠體金法檢測試劑受環境溫度、臨床送檢樣品性狀不一致等因素影響，具體操作規程有待進一步標準化。膠體金法檢測抗體還存在重復性欠佳，試劑批間差較大，不能準確定量，檢測成分較單一等缺點[20]。因此，在選擇膠體金法進行SARS-CoV-2抗體檢測時，應充分考慮其利弊。未來膠體金法在提高靈敏度和特異性同時，也將由定性向定量檢測和多元檢測的方向發展，這種簡單快速的檢測技術將會得到更加廣泛的應用。

表1 3家公司膠體金法檢測血清 SARS-CoV-2總抗體結果(n)

表2 3家公司膠體金法檢測血清 SARS-CoV-2總抗體靈敏度和特異性(%)

3 化學發光免疫分析(CLIA)技術檢測SARS-CoV-2抗體的研究現狀

CLIA是目前最先進的免疫檢測技術之一，具有高靈敏度、快速、準確等優點。CLIA現已廣泛運用于檢驗科的日常工作中，如各種感染性抗體、激素、腫瘤標志物、藥物濃度監測等微量物質的檢測[21]。自COVID-19疫情暴發，國內多家公司先后研制出SARS-CoV-2抗體化學發光免疫檢測試劑盒，且部分已獲得CFDA批準。下文將根據目前公開數據對博奧賽斯(天津)生物科技有限公司、深圳亞輝龍公司、廈門萬泰滄海生物技術有限公司的SARS-CoV-2抗體化學發光免疫檢測試劑進行臨床診斷效能評估，為臨床應用提供參考。

博奧賽斯(天津)公司在4家醫療機構對其公司的SARS-CoV-2 IgM、IgG抗體化學發光免疫檢測試劑(磁微?；瘜W發光法)進行了臨床研究(數據摘自產品說明書)。結果顯示，SARS-CoV-2 IgM抗體檢測試劑盒靈敏度為88.30%，特異性為99.50%；SARS-CoV-2 IgG抗體檢測試劑盒臨床靈敏度為87.23%，特異性為99.25%；IgM和IgG抗體檢測試劑盒聯合檢測時，靈敏度為94.33%，特異性為99.50%；對常見15種病毒無交叉反應。該公司試劑用于定性檢測人血清樣本中SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體，其明確指出該試劑僅用作對新型冠狀病毒核酸檢測陰性疑似病例的補充檢測指標或疑似病例診斷中與核酸檢測協同使用，不適用于一般人群的篩查。

深圳亞輝龍公司對其SARS-CoV-2 IgM和IgG試劑在13家醫院進行了診斷效能評估，結果顯示，IgM試劑靈敏度和特異性分別為86.6%和98.3%；IgG試劑靈敏度和特異性分別為96.3%和97.4%(數據來源：檢驗視界網)。徐萬洲等[22]對深圳亞輝龍公司試劑進行性能驗證后發現：SARS-CoV-2 IgM抗體靈敏度和特異性為70.24%和96.20%；SARS-CoV-2 IgG靈敏度和特異性分別為96.10%和92.41%。李泉等[23]也對該公司SARS-CoV-2抗體進行了臨床評估，發現SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體臨床靈敏度高達96%；臨床特異性為100%。該研究認為化學發光檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體對COVID-19患者特別是疑似COVID-19患者無論在確診和排除方面都將是對核酸檢測方法不足的補充。另唐鵬等[24]采用廈門萬泰公司Caris200系列檢測了核酸持續陽性、核酸陽性轉陰和核酸陰性疑似患者SARS-CoV-2總抗體水平，結果發現：核酸持續陽性組，檢測靈敏度為87.5%，特異性為100.0%；核酸陽轉陰組，檢測靈敏度為95.2%，特異性為100.0%；核酸陰性疑似組，檢測靈敏度為94.9%，特異性為100.0%。作者就目前臨床診療中最棘手的咽拭子核酸持續陰性的疑似病例進行了研究，結果表明SARS-CoV-2總抗體檢出率高達94.9%，很大程度彌補了核酸檢測的假陰性。

化學發光免疫檢測系統除靈敏度高外，多數公司試劑還可對SARS-CoV-2抗體進行定量檢測，以便提示病情發展?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案(試行第七版)》中確診病例中提出“血清新型冠狀病毒特異性IgG抗體恢復期較急性期4倍及以上升高”，即需要對抗體進行定量檢測。此外，有研究檢測了COVID-19患者咽拭子SARS-CoV-2核酸陽性和核酸轉陰時血清IgM和IgG抗體的濃度變化，發現核酸轉陰后患者血清IgM抗體濃度明顯低于轉陰前，但血清IgG抗體在核酸轉陰前后無明顯差異[16]。通常人體感染病毒后IgM和IgG水平會發生規律變化，若IgM抗體濃度逐漸降低，而IgG抗體濃度持續陽性，說明患者已經產生相應的免疫力，正向痊愈方向發展。

對上述化學發光法SARS-CoV-2抗體檢測試劑的性能驗證結果(表3～4)進行分析后發現：(1)各公司SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測試劑的特異性并無差異(表5～6)；(2)廈門萬泰公司和博奧賽斯(天津)公司IgM抗體檢測靈敏度明顯高于深圳亞輝龍公司，差異有統計學意義(P<0.000 1)，廈門萬泰公司和博奧賽斯(天津)公司IgM抗體檢測靈敏度無差異，但深圳亞輝龍公司IgG抗體檢測靈敏度明顯高于博奧賽斯(天津)公司，差異有統計學意義(P=0.000 2)。因廈門萬泰公司尚無IgG抗體靈敏度和特異性的相關數據，未納入統計，各公司IgM和IgG抗體聯合檢測數據不全，未納入統計。

表3 3家公司化學發光法檢測血清SARS-CoV-2IgM抗體結果(n)

表4 2家公司化學發光法檢測血清 SARS-CoV-2IgG抗體結果(n)

表5 3家公司化學發光法檢測血清SARS-CoV-2 IgM抗體的靈敏度和特異性(%)

表6 2家公司化學發光法檢測血清 SARS-CoV-2 IgG抗體靈敏度和特異性(%)

有研究比較了化學發光法和膠體金法檢測SARS-CoV-2 特異性抗體的靈敏度和特異性，發現膠體金法和化學發光法檢測SARS-CoV-2總抗體的臨床特異性無差異，且僅在核酸陽轉陰組和疑似組化學發光法檢測總抗體的靈敏度明顯優于膠體金法[24]。根據現公開數據，對兩種方法各公司SARS-CoV-2 IgM抗體檢測試劑靈敏度和特異性進行分析后發現：(1)無論采用化學發光法還是膠體金法，各公司檢測SARS-CoV-2 IgM抗體的特異性無統計學差異；(2)僅博奧賽斯(天津)公司化學發光法檢測SARS-CoV-2 IgM抗體較兩家公司膠體金法靈敏度高，差異有統計學意義(P<0.000 1)。見表7。

表7 5家公司檢測血清 SARS-CoV-2 IgM抗體靈敏度和特異性(%)

4 小 結

目前，CFDA批準上市的SARS-CoV-2血清學特異抗體檢測試劑主要差異集中在檢測靈敏度和檢測抗體種類上，其性能均可滿足臨床需求。膠體金法和化學發光法檢測SARS-CoV-2血清學特異抗體各有優缺點。膠體金法操作簡單，無須特殊設備，15～30 min內完成檢測，成本比較低，對硬件要求不高，可用于基層實驗室和大規模樣本篩查。膠體金法的缺點是靈敏度較低，只能做定性檢測?；瘜W發光法靈敏度和特異性均較高，能進行定量檢測，可批量操作，但需要特殊儀器，適合在大中型醫院開展。但目前通過CFDA批準的SARS-CoV-2抗體化學發光檢測試劑盒為封閉系統，導致其使用受限。實驗室在選擇檢測方法時，必須確定其目標，快速和敏感的檢測方法有助于及時對患者診療和感控隔離。然而，目前沒有診斷方法能達到100%的靈敏度和特異性，同時都需通過質控方案進行控制，以減少假陽性和假陰性結果的發生。除建立和遵循檢驗前、中、后標準操作程序外，還應定期利用陽性和陰性質控品來評估檢測性能，通過參加室間質評活動以驗證其準確度。此外，在病毒變異時，已有檢測方法的靈敏度可能會改變，應重新評估其檢測效能，特別是當檢測結果與臨床和流行病學預期不匹配時[25-26]。

綜上所述，檢驗機構無論采用何種檢測方法，血清特異性抗體檢測都是目前解決SARS-CoV-2核酸檢測“假陰性”的一個行之有效的辦法，甚至有研究顯示將核酸與抗體聯合檢測可明顯提高診斷效率。盡管如此，各實驗室在項目開展前，應充分考慮其檢測方法學的利弊，合理評估各廠家檢驗系統的性能。