玻璃酸鈉上調miR-92a-3p表達保護IL-1β誘導的軟骨細胞損傷

顏逸鵬 林樹峰 張澤鋒 葉暉

福建醫科大學附屬第二醫院骨科（福建泉州362000）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的慢性退行性疾病，主要發生在50 歲以上的中老年人群，女性患者多于男性。其主要病灶范圍有滑膜組織、軟骨組織、關節周圍肌肉組織及軟骨下骨。其病變特征為關節軟骨退行性病變、關節骨質邊緣及關節軟骨下骨出現增生、關節變性，嚴重者可致殘，嚴重影響患者的生活質量[1-3]。在OA 發生的初期，關節軟骨會出現異常，表面光澤逐漸消失，顏色由透明的乳白色變為淡黃色。此時，其表面會出現裂縫，軟骨組織開始出現軟化，膠原纖維發生變性。當患者病情加重后，軟骨表面裂縫會逐漸加深，最終影響深層的軟骨組織[4-6]。OA的惡化會增加細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的降解及細胞中基質金屬蛋白酶（matrix metalloprotein?ases，MMPs）家族蛋白的表達，最終導致軟骨細胞發生凋亡[7]。已有研究證明，在正常軟骨組織中，發生凋亡的軟骨細胞占5%，而OA 軟骨組織中發生凋亡的軟骨細胞高達22%[8]。

在正常情況下，軟骨組織中軟骨細胞的增殖與凋亡、ECM 的生成與降解都應保持在一個相對平衡的狀態，以此來保證關節軟骨的正常功能。而在這過程中，炎癥因子也發揮了重要的作用。細胞白介素-1（inter?leukin-1，IL-1）是一種由軟骨細胞分泌的促炎細胞因子，其在正常的軟骨組織中含量較低，主要以IL-1β的形式存在[9-11]。Zhou 等研究發現，IL-1β的表達水平在OA患者中顯著增加，且其表達水平與軟骨細胞的損傷程度成正比[12]。另也有研究發現，IL-1β能降低ECM中蛋白聚糖的合成，增加MMP-3及MMP-13的表達[13]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類大約由18～25個堿基核苷酸構成的單鏈非編碼小RNA，已有研究證明miRNA參與了軟骨形成及重塑的過程[14]。Dimitri?os 等發現，miR-22 可通過調節骨形成蛋白-7（bone morphogenetic protein，BMP-7）及過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor al?pha，PPARA）的表達，使軟骨細胞中ECM 發生降解[15]。Tuddenham等則發現，miR-140在軟骨細胞中特異性表達，與軟骨的形成密切相關[16]。miR-92a-3p 被證明是一種新型的敏感且可靠的生物標志物，已被證明可用于多種惡性腫瘤和炎癥疾病的診斷及預后評估[17-19]。張明煥等研究表明，與正常軟骨細胞相比，miR-92a-3p在IL-1β誘導的軟骨細胞中表達顯著降低[20]。Mao等發現，人骨髓間充質干細胞分泌包裹miR-92a-3p的外泌體，可通過靶向WNT5A抑制軟骨降解[21]。

玻璃酸鈉（hyaluronic acid sodium，HA）又稱透明質酸鈉，是構成關節軟骨和滑液的主要成分，是一種主要由葡萄糖醛酸和乙酰氨基己糖聚合而成的黏多糖物質，在關節腔內起潤滑、覆蓋屏障及緩沖應力的作用，已成為治療骨關節炎的藥物之一[22]。已有研究證明，外源性HA注射可以顯著抑制OA患者關節液中IL-1β的含量，以達到治療OA 的目的，但其具體的調控機制尚不清楚[23]。鑒于此，本研究擬探討HA是否通過調節miR-92a-3p對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的作用機制產生影響，以期為OA的治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

人軟骨細胞（CHON-001細胞）購于美國ATCC（美國馬薩諸塞州弗吉尼亞州）。

1.1.2 實驗主要儀器與試劑

Dulbecco’s 改良培養基（上海賽默飛世爾科技公司）；real-time PCR 試劑（北京天根生化科技公司）；Trizol 試劑、Lipofectamine 2000 轉染試劑（美國Invitro?gen 公司）；SYBR Green PCR Master Mix（美國Life Technologies公司）；Annexin-V/PI細胞凋亡檢測試劑盒（上海生工）；PIPA裂解緩沖液（碧云天生物技術公司）；miR-92a-3p 抑制劑（miR-92a-3p inhibitor）、miR-92a-3p 模擬物（miR-92a-3p mimics）和相應對照（in?hibitor-NC、mimics-NC）（上海吉瑪制藥技術有限公司）；COL2A1 抗體、MMP-3 抗體、MMP-13 抗體、β-ac?tin抗體、HRP 標記的二抗（美國Abcam 公司）；全自動酶標儀、流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

CHON-001 細胞在含10%胎牛血清的Dulbecco’s改良培養基中，37℃、5%CO2的條件下培養。穩定傳代3代，取第3代對數生長期的細胞進行后續試驗。

1.2.2 細胞轉染及分組

取對數生長期的CHON-001細胞接種于6孔板中，用含10%胎牛血清的Dulbecco’s改良培養基培養細胞至70%～80%融合時，按Lipofectamine 2000 轉染試劑說明書配置miR-92a-3p inhibitor、inhibitor-NC、miR-92a-3p mimics 和mimics-NC 的轉染復合物懸液，并將其加入到對應的6孔板中，每孔加入1×Opti-MEM培養基調整體積至2 ml，置于37℃、5%CO2的條件下繼續培養48 h。將CHON-001 細胞按下述處理方式進行分組：①Control 組：用PBS處理未經轉染的CHON-001細胞24 h；②IL-1β組：用0.1 μL 提前配置好的10 ng/ml的IL-1β誘導未經轉染的CHON-001 細胞24 h；③IL-1β mimics-NC 組和IL-1β miR-92a-3p mimics 組：用0.1 μL 提前配置好的10 ng/ml 的IL-1β分別誘導經mimics-NC、miR-92a-3p mimics 轉染的CHON-001 細胞24 h；④IL-1β+HA 組：用0.1 μL 提前配置好的10 ng/ml的IL-1β誘導未經轉染的CHON-001細胞24 h后加入0.1 μL 100 μg/ml HA 培養24 h；⑤IL-1β+HA inhibitor-NC組、IL-1β+HA miR-92a-3pinhibitor組：用0.1 μL提前配置好的10 ng/ml的IL-1β分別誘導經in?hibitor-NC、miR-92a-3p inhibitor轉染的CHON-001細胞24 h后分別加入0.1 μL 100 μg/ml HA培養24 h。

1.2.3 qRT-PCR檢測

轉染48 h 后，用qRT-PCR 法測定細胞中miR-92a-3p 表達變化。按照Trizol 說明書提取各組細胞中的總RNA，之后取1 μg 總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。PCR 體系（10 μL）：SYBR Premix Ex Taq 5 μL、cDNA 樣本1 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、ROX Reference Dye II（50×）0.2 μL，加ddH2O 至10 μL。PCR 擴增反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，40 個循環；60 ℃退火和延伸35 s，用2－△△Ct法計算基因表達的相對倍數。引物信息：miR-92a-3p（上游引物：5’-CACTTGTCCCGGCCT?GTAAA-3’，下游引物：5’-TATTGCACTTGTCCCG?GCCTG-3’）。

1.2.4 MTT法檢測細胞活力

將各組細胞懸液密度調整至4×103個/ml后接種于96 孔板（200 μl/孔），繼續培養48 h 后，加入20 μL 四甲基偶氮唑鹽（MTT）孵育4 h，棄去上清后，加入二甲基亞砜振蕩反應15 min。用多功能酶標儀檢測450 nm處各組細胞的OD值，實驗重復三次。各組OD值取平均值后，根據下述公式計算細胞活力：細胞活力%=（OD實驗/OD對照）×100%。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

將各組細胞消化制成單個細胞懸液，之后將其按每孔1×105個細胞接種至24孔板中，每孔體積400 μL，每組3個復孔。培養48 h后收集各組細胞，于1000 r/min 離心5 min，之后用PBS 清洗2 遍，并棄去上清液。加入試劑盒中的緩沖液，混合均勻后加入5 μL An?nex-inV/FITC和10 μL PI，于室溫避光孵育15 min，用流式細胞儀上樣檢測，并借助Cell Quest軟件分析細胞凋亡率。

1.2.6 Western blot檢測

在冰上提取培養48 h的各組細胞的總蛋白，通過BCA 法測定蛋白的濃度，經SDS-PAGF 電泳將蛋白轉入PVDF 膜上，然后將膜在5%牛奶中封閉1 h，之后加入一抗（1∶500 稀釋的抗-COL2A1、抗-MMP-13、抗-MMP-3、抗-β-actin），4 ℃孵育過夜，PBST 漂洗3 次，加入HRP標記的二抗（1∶500），室溫條件下孵育1 h，再次用PBST漂洗3次，最后滴加ECL曝光顯影。

1.3 統計學分析

所有數據通過SPSS 22.0軟件進行統計分析，實驗結果以平均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 qRT-PCR 檢測轉染后細胞miR-92a-3p 含量的變化

與轉染相應陰性對照及Control 組相比，經miR-92a-3p mimics 轉染后，軟骨細胞中miR-92a-3p 的表達水平顯著升高（P＜0.01）；而經miR-92a-3p inhibitor轉染后，軟骨細胞中miR-92a-3p的表達水平顯著降低（P＜0.01）（見圖1）。

圖1 轉染后miR-92a-3p的相對表達量

2.2 qRT-PCR 檢測miR-92a-3p 在不同處理組中差異表達

與Control組相比，IL-1β組及IL-1β mimics-NC組miR-92a-3p 表達水平顯著降低，IL-1β miR-92a-3p mimics 組miR-92a-3p 表達水平顯著升高（P＜0.01）；與IL-1β組及IL-1β mimics-NC 組相比，IL-1β miR-92a-3p mimics 組miR-92a-3p 表達水平顯著升高（P＜0.01）（見圖2）。

圖2 miR-92a-3p在各組軟骨細胞中的表達

2.3 過表達miR-92a-3p對軟骨細胞活力的影響

與Control組相比，IL-1β組和IL-1β mimics-NC組細胞活力顯著降低（P＜0.01）；與IL-1β 組和IL-1β mimics-NC組相比，IL-1β miR-92a-3p mimics組細胞活力顯著升高（P＜0.01）（見圖3）。

圖3 miR-92a-3p對各組軟骨細胞活力的影響

2.4 過表達miR-92a-3p對軟骨細胞凋亡的影響

與Control組相比，IL-1β組和IL-1β mimics-NC組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與IL-1β組和IL-1β mimics-NC組相比，IL-1β miR-92a-3p mimics組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）（見圖4）。

圖4 miR-92a-3p對各組軟骨細胞凋亡的影響

2.5 過表達miR-92a-3p對軟骨細胞COL2A1、MMP-13及MMP-3蛋白表達的影響

與Control組相比，IL-1β組和IL-1β mimics-NC組COL2A1 蛋白表達顯著降低（P＜0.01），MMP-13 蛋白及MMP-3 蛋白的表達顯著升高（P＜0.01）；與IL-1β組和IL-1β mimics-NC 組相比，IL-1β miR-92a-3p mimics組COL2A1 蛋白顯著升高（P＜0.01），MMP-13 蛋白及MMP-3蛋白的表達顯著降低（P＜0.01）（見圖5）。

圖5 miR-92a-3p對各組軟骨細胞COL2A1、MMP-13及MMP-3蛋白表達的影響

2.6 HA對IL-1β誘導的軟骨細胞miR-92a-3p表達的影響

與IL-1β組相比，IL-1β+HA 組和IL-1β+HA in?hibitor-NC 組miR-92a-3p 表達顯著升高（P＜0.01）；與IL-1β+HA 組和IL-1β+HA inhibitor-NC 組相比，IL-1β+HA miR-92a-3p inhibitor組miR-92a-3p表達顯著降低（P＜0.01）（見圖6）。

圖6 HA對IL-1β誘導的軟骨細胞miR-92a-3p表達的影響

2.7 HA對IL-1β誘導的軟骨細胞活力的影響

與IL-1β組相比，IL-1β+HA 組和IL-1β+HA in?hibitor-NC 組細胞活力顯著升高（P＜0.05）；與IL-1β組和IL-1β+HA inhibitor-NC 組相比，IL-1β+HA miR-92a-3p inhibitor 組細胞活力顯著降低（P＜0.05）（見圖7）。

圖7 HA對IL-1β誘導的軟骨細胞活力的影響

2.8 HA對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡的影響

與IL-1β組相比，IL-1β+HA 組和IL-1β+HA in?hibitor-NC 組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）；與IL-1β組和IL-1β+HA inhibitor-NC組相比，IL-1β+HA miR-92a-3p inhibitor 組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）（見圖8）。

圖8 HA對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡的影響

2.9 HA 對IL-1β誘導的軟骨細胞COL2A1、MMP-13及MMP-3蛋白表達的影響

與IL-1β組相比，IL-1β+HA 組和IL-1β+HA in?hibitor-NC 組COL2A1 蛋白表達顯著升高（P＜0.01），MMP-13 蛋白及MMP-3 蛋白的表達顯著降低（P＜0.01）；與IL-1β+HA組和IL-1β+HA inhibitor-NC 組相比，IL-1β+HA miR-92a-3p inhibitor 組COL2A1 蛋白顯著降低（P＜0.01），MMP-13 蛋白及MMP-3 蛋白的表達顯著升高（P＜0.01）（見圖9）。

圖9 HA對IL-1β誘導的軟骨細胞COL2A1、MMP-13及MMP-3蛋白表達的影響

3 討論

OA是一種以軟骨退行性病變為特征的慢性疾病，具有復雜的發病機制。已有研究證明，軟骨細胞的凋亡和細胞外基質的降解會最終導致軟骨破壞。IL-1β是一種炎性細胞因子，它可以刺激軟骨細胞，以誘導其產生MMPs，在軟骨基質降解中起十分重要的作用。Ⅱ型膠原纖維α1 基因（COL2A1）是構成軟骨基質膠原的主要成分，是軟骨細胞的標志[24]。王曉峰等發現，與對照組相比，OA 組軟骨細胞中COL2A1 的mRNA 表達顯著減少[25]。已有研究表明，在OA發生的過程中，MMPs的分泌增多會加重軟骨基質的損傷[26]。夏漢庭等發現，MMP-13和MMP-3能直接或間接裂解Ⅱ型膠原，抑制MMP-13 和MMP-3 的表達在體內外實驗中均能起到抗OA 的作用[27]。李保馳的研究表明，與非OA 組相比，MMP-13 和MMP-3 蛋白在OA 組滑膜中的表達量顯著升高[28]。在本研究中，我們首先證實了與正常軟骨細胞相比，經IL-1β誘導的軟骨細胞中MMP-13 及MMP-3的表達顯著升高，COL2A1的表達顯著降低，這與之前的研究結果相一致。

miRNA 是一類高度保守的非編碼小RNA，其可通過與靶基因mRNA的5’UTR結合在轉錄水平上對基因的表達進行調控。已有研究表明，miRNA 不僅參與包括增殖、分化、發育、凋亡等人體正常的生理過程，還參與很多的病理過程。Zhang等發現，miR-21在OA患者體內的表達顯著升高，且與關節軟骨的形成密切相關[29]。Akhtar等證明，miR-101-3p在IL-1β誘導的軟骨細胞中表達降低[30]。Zhang等的研究表明，miR-502-5p能降低IL-1β誘導的軟骨細胞中MMPs的分泌，從而緩解軟骨細胞損傷[31]。miR-92a-3p是目前較為公認的致癌miRNA，它可通過阻遏PTEN 介導的PI3K/AKT 通路引起腫瘤細胞的侵襲和轉移[18，32]。Tsuchida等發現，miR-92a-3p 在結腸癌患者中的表達水平顯著升高[33]。Mao等的研究則表明，miR-92a-3p 在OA 患者的軟骨中表達降低[34]。本研究發現，miR-92a-3p 在IL-1β誘導的軟骨細胞中表達降低，這與張明煥等的研究結果一致[20]。在此基礎上，本研究還表明過表達miR-92a-3p 可減緩IL-1β誘導造成的細胞凋亡，降低細胞中MMP-13及MMP-3蛋白的表達，增加COL2A1蛋白表達。

現階段OA 的治療重點主要圍繞針對性減輕患者疼痛、改善關節功能、延緩病情等方面進行，可用于進行保守治療的藥物主要有非甾體抗炎藥、解熱鎮痛抗炎藥、類固醇類藥物及關節內注射HA 等[35，36]。其中，最直接、副作用最小的就是HA關節腔內注射治療。盡管如此，目前卻鮮有與HA 治療OA 相關的機制研究。本研究發現，HA 可以通過上調IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-92a-3p的表達，進而增加COL2A1蛋白的表達，降低MMP-13蛋白及MMP-3蛋白的表達，而抑制細胞中miR-92a-3p的表達，則會抵消這一反應。

4 結論

綜上所述，本研究結果顯示HA 能通過上調miR-92a-3p 的表達，進而明顯減輕IL-1β誘導的軟骨細胞損傷，這表明miR-92a-3p 在OA 的發生發展中可能起關鍵作用，這也為進一步研究miR-92a-3p 在OA 發病機制中的作用奠定了理論基礎，但其具體的作用機制還需進一步證實。