有氧運動對大鼠海馬和大腦皮質P2X7受體表達的影響

沈鈺琳 王雪冰，2 馮連世 路瑛麗

1 國家體育總局體育科學研究所（北京100061）

2 廣西大學體育學院（南寧530004）

嘌呤能信號傳遞開始于細胞向胞外分泌以三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）為主的核苷酸。嘌呤受體按照作用物不同分為腺苷作用的Pl受體和ATP及其類似物作用的P2受體[1]。核苷酸P2X受體屬于配體門控的離子通道，具有傳遞細胞外ATP 的離子轉換作用，在哺乳動物中已發現P2X 受體的7 個亞型（P2X1-7），廣泛分布于呼吸系統、消化系統、心血管系統、生殖系統、骨骼肌系統和神經系統[2-3]。其中的一個亞型嘌呤2X7受體（Purinergic 2X7 receptor，P2X7）被高濃度的細胞外ATP激活，使Ca2+和Na+進入，K+通過漿膜向外流動，經過多次刺激后，形成更大的膜孔，影響細胞穩態[4]。有研究發現，P2X7受體在大腦海馬、皮質等多個區域以及脊髓等組織都有表達，參與調節中樞神經系統生理功能，與神經病理痛、抑郁癥、癲癇、阿爾茨海默癥等疾病的發病相關[5-7]。此外，P2X7可導致小膠質細胞激活，促進炎癥因子白細胞介素1β（interleu?kin-1β，IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF -α）的產生，加重神經退行性疾病中的細胞損傷[8]。有研究表明P2X7可能激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和絲裂酶原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，并與炎癥性疾病密切相關[9]。

研究顯示，有氧運動對改善中樞神經系統功能，延緩帕金森、阿爾茨海默癥等神經退行性疾病有著積極的作用[10-11]，但目前關于有氧運動對中樞神經系統功能的調控機制尚不十分明確。因此，本研究通過4 周有氧訓練，觀察大鼠海馬和大腦皮質P2X7受體及其相關信號通路表達的變化，為有氧運動保護大鼠中樞神經系統功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

14 周齡雄性SD 大鼠20 只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體重460～520 g。大鼠在自然光照、環境溫度21°C ～23°C、濕度40%～60%的動物房內飼養，自由進水進食。2 周的適應性喂養和訓練（速度從16 m/min 逐步遞增到30 m/min，運動時間從20 min/d遞增到60 min/d）后，隨機分為安靜組（C組）和訓練組（T 組），每組10 只。訓練組大鼠于水平跑臺進行有氧耐力訓練，采用中等強度跑臺訓練，相當于50%VO2max 運動負荷強度，跑臺訓練速度為30 m/min，每天運動1小時，每周5天，共4周[12]。

1.2 取材

訓練第4周末，各組大鼠禁食禁水12 h，給予10%水合氯醛溶液（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，每組取6只大鼠腹主動脈取血，斷頭。迅速放在冰袋上取雙側海馬和部分大腦皮質，PBS漂洗后置于凍存管，放入液氮罐內冷凍，隨后將樣品轉入－80℃冰箱中保存，用于RT-qPCR、Western Blot 和ELISA 檢測。每組剩余4 只大鼠，麻醉后斷頭，完整取下整個大腦，置于4% PFA中固定，放入4℃冰箱保存，用于免疫熒光檢測。

1.3 主要試劑與儀器

兔抗P2X7 多克隆抗體（Alomone Labs），兔抗NFκB p65多克隆抗體（Affinity），山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG（Jackson），小鼠抗GFAP 多克隆抗體（Bioleg?end），小鼠抗β-actin 單克隆抗體，兔抗P38 多克隆抗體、兔抗p-P38 多克隆抗體、兔抗JNK 多克隆抗體、兔抗p-JNK多克隆抗體（CST），辣根酶標記的山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記的山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋），Trizol 試劑（Invitrogen），逆轉錄試劑盒、Premix Taq?（Ex Taq? Version 2.0）試劑盒（TaKaRa），TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒（eBioscience），Roche Light?Cycler?480II 實時熒光定量PCR 系統（Roche，CH），倒置顯微鏡（Olympus），成像系統（Q-Imaging）。

1.4 RT-qPCR檢測

應用RT-qPCR 檢測各組大鼠海馬和大腦皮質P2X7 mRNA 表達。將－80℃冰箱中的海馬和大腦皮質組織取出，分別置于勻漿器（預先用DEPC 處理）中，放在冰盒內研磨。加入Trizol 混合提取RNA，再加入100 μl無核酶水，溶解RNA。用分光光度計讀取OD260/OD280比值及RNA 濃度。根據逆轉錄試劑盒說明書條件將提取的RNA 取1 μg 逆轉錄成cDNA。按照Pre?mix Taq?（Ex Taq?Version 2.0）說明書要求，配制10 μl 的反應體系。引物序列如下：P2X7 上游引物5’-GATGGATGGACCCACAAAGT-3’，下游引物5’-GCTTCTTTCCCTTCCTCAGC-3’；β-actin 上游引物5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’，下游引物5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’。使用Roche LightCycler?480II 實時熒光定量PCR 系統進行擴增并對結果進行分析。設置PCR 反應條件：95°C 5 min預變性后，95°C 10 s，60°C 30 s，72°C 30 s，40 個循環。結果使用2－△△CT法表示目的基因相對表達量。

1.5 Western Blot檢測

應用Western Blot 檢測大鼠海馬、大腦皮質P2X7、核轉錄因子-κB p65（nuclear factor kappa-B p65 p65）、p38 絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activat?ed protein Kinase，p38）、磷酸化p38（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinas，p-p38）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷酸化JNK（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）蛋白的表達。取大鼠海馬和大腦皮質置于組織勻漿器中，預冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑，研磨混勻；置于低溫離心機（4℃）中12000 rpm 離心15 min，取上清，加入6×loading buffer，放入120°C水浴鍋中加熱5 min使蛋白變性。SDS-PAGE 電泳，轉膜，根據抗體條帶位置剪下合適寬度的膜，分別浸在一抗兔抗P2X7 IgG（1 ∶300）、兔抗NF-κB p65 IgG（1:500）、兔抗P38 IgG（1∶1000）、兔抗p-P38 IgG（1∶1000）、兔抗JNK IgG（1∶1000）、兔抗p-JNK IgG（1∶1000），以及小鼠抗β-actin IgG（1∶1000）中，4℃孵育過夜。TBST漂洗3次，每次10 min，將膜轉至山羊抗兔IgG-HRP（1 ∶10000）、山羊抗 小 鼠IgG-HRP（1 ∶10000）二抗中室溫震蕩孵育1 h，TBST 清洗3 次，每次10 min。ECL 滴加到膜的蛋白面，反應3～5 min；膠片曝光10 s～5 min（曝光時間隨不同光強度調整），顯影2 min，定影。通過Image-Pro Plus 圖像分析軟件讀取目的條帶的光密度掃描值，以各組條帶β-actin 的掃描值標化其相應組待測因子的蛋白表達量。

1.6 免疫熒光染色

應用免疫熒光染色法觀察大鼠海馬、大腦皮質P2X7陽性細胞的表達。將已在4%PFA中固定48 h后的大鼠大腦組織取出，4 °C脫水（浸入30%的蔗糖24 h進行脫水處理，每8 h更換一次蔗糖水）。用恒冷切片機將組織切成10～12 μm厚的薄片，放入烤箱37°C烤片2 h，－20 °C 保存。取出切片平衡室溫30 min，用PBS 緩沖液清洗3 次，每次5 min。滴加10%山羊血清于37°C水浴鍋內封閉1 h。用濾紙擦干封閉液，PBS清洗3 次，每次5 min，擦干，按比例配制一抗（P2X7 稀釋比例1∶100），混勻，滴加在玻片上覆蓋組織，放入4°C冰箱過夜。次日室溫放置30 min后，用PBS清洗3次，每次5 min 洗去一抗后加入帶有熒光標記的二抗（山羊抗兔TRITC：1∶200），放入37°C 水浴鍋中避光孵育1 h。置于PBS緩沖液避光洗滌3次，每次5 min，用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，分析結果。

1.7 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）

采用ELISA 實驗檢測各組大鼠海馬和大腦皮質TNF -α、IL-1β和IL-6 的表達水平。取各組大鼠部分海馬和大腦皮質加入PBS 于冰上研磨，4℃條件下12000 r/min 離心15 min，取上清。從冰箱內取出試劑盒，置于室溫下平衡30 min。標準品、生物素標記抗體、ABC 工作液按試劑盒說明書的要求配置。核算樣本所需的已包被抗體的酶標板孔數目，參照試劑盒說明書完成后續各步驟操作。用酶標儀在450 nm 測定吸光值。繪制標準曲線，根據樣本吸光值，計算樣本中TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度。

1.8 統計學分析

應用SPSS 21.0統計軟件進行統計學分析，所有統計數據結果以均數± 標準差（x±s）表示，顯著性檢驗選擇獨立樣本t檢驗。P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 有氧運動對大鼠海馬和大腦皮質P2X7表達的影響

實驗結果顯示，經過4 周有氧運動，T 組大鼠海馬（0.25 ± 0.05）和大腦皮質（0.42 ± 0.07）P2X7 mRNA的表達水平較C 組（1.00 ± 0.00）顯著下降（P＜0.01）（圖1A）；在P2X7 蛋白表達水平方面，T 組大鼠海馬（0.45 ± 0.09）和大腦皮質（0.38 ± 0.11）較C 組海馬（0.98 ± 0.09）和大腦皮質（0.79 ± 0.13）均顯著下降（P＜0.01）（圖1B、C）。

圖1 各組大鼠海馬和大腦皮質P2X7 mRNA和蛋白的表達

2.2 各組大鼠海馬和大腦皮質P2X7免疫熒光染色結果

圖2 結果顯示，T 組大鼠海馬和大腦皮質P2X7 免疫熒光染色陽性細胞數量顯著少于C 組（P＜0.01），其中，T 組大鼠海馬P2X7 陽性細胞比例為6.58% ±2.14%，C組25.20% ± 3.82%；大腦皮質中P2X7陽性細胞的表達比例為T 組55.22% ± 4.38%，C 組80.50% ±7.87%。

圖2 各組大鼠海馬和大腦皮質P2X7免疫熒光染色

2.3 有氧運動對大鼠海馬和大腦皮質p65、P38、JNK信號通路表達的影響

結果顯示，4 周有氧訓練后，各組大鼠海馬和大腦皮質中P38、JNK 蛋白的表達無顯著差異（P＞0.05），在海馬組織中，C 組大鼠P38 和JNK 蛋白表達量分別為0.89 ± 0.10、0.52 ± 0.09，T 組分別為0.95 ± 0.13、0.53 ± 0.10；在大腦皮質中，C 組大鼠P38 和JNK 蛋白表達量分別為0.91 ± 0.19、0.85 ± 0.17，T 組分別為0.94 ± 0.17、0.83 ± 0.14（圖3B、C）。

與C 組相比，T 組大鼠海馬和大腦皮質p65、p-P38以及p-JNK蛋白表達水平均顯著下降（P＜0.01），其中，C 組大鼠海馬p65、p-P38 和p-JNK 蛋白表達量分別為1.05 ± 0.18、0.61 ± 0.14、1.06 ± 0.15，T 組分別為0.53 ± 0.10、0.32 ± 0.09、0.69 ± 0.10；C 組大鼠大腦皮質p65、p-P38 和p-JNK 蛋白表達量分別為0.99 ±0.12、1.01 ± 0.18、1.06 ± 0.17，T 組分別為0.54 ±0.11、0.42 ± 0.10、0.61 ± 0.12（圖3D、E、F）。

圖3 各組大鼠海馬和大腦皮質p65、P38、p-P38、JNK、p-JNK蛋白的表達

2.4 有氧運動對大鼠海馬和大腦皮質炎癥因子表達的影響

圖4 結果顯示，T 組大鼠海馬和大腦皮質TNF-α、IL-1β和IL-6 較C 組均顯著下降（P＜0.01）。其中，T 組大鼠海馬TNF-α、IL-1β和IL-6 的表達量分別為10.98± 0.99、4.26 ± 0.14、14.22 ± 2.00，C 組分別為13.49± 0.88、5.27 ± 0.31、22.65 ± 2.74；T 組大鼠大腦皮質TNF-α、IL-1β和IL-6 的表達量分別為50.00 ± 2.63、3.87 ± 0.37、14.52 ± 3.73，C 組分別為63.20 ± 6.63、5.99 ± 0.94、30.78 ± 2.28。

圖4 各組大鼠海馬和大腦皮質TNF-α、IL-1β和IL-6的表達

3 討論

P2X7受體在神經系統的幾種細胞類型，包括星形膠質細胞、少突膠質細胞、小膠質細胞、施萬細胞和一些神經元中都有表達[13-14]。其與許多神經系統疾病相關聯，如多發性硬化癥、阿爾茨海默病、亨廷頓病和癲癇等。在中樞神經系統中，P2X7受體被激活后會導致主要興奮性神經遞質谷氨酸和ATP的釋放[15]。在成年人大腦中，P2X7受體參與神經元細胞在發育和死亡過程中向膠質細胞表型的分化[16-17]。有研究發現，脊髓損傷與P2X7受體激活時間延長有關，可導致神經元興奮性毒性[18]。有氧運動對多種中樞神經系統疾病如阿爾茲海默癥、帕金森病的恢復以及延緩大腦衰老都具有積極作用，長期有氧運動能夠增強海馬神經元活性，減少脊髓前角神經元的丟失，對神經元產生保護作用[19-20]。此外，有氧運動還可通過抑制P2X7 受體改善高脂飲食大鼠心肌炎癥、纖維化和細胞凋亡，降低氧化應激反應，延緩大鼠糖尿病腎病的病程進展[21-22]。本研究結果顯示，經過4 周跑臺訓練后，T 組大鼠中樞神經系統海馬、大腦皮質組織中的P2X7受體mRNA和蛋白表達水平較C 組大鼠均顯著下降，且免疫熒光實驗結果顯示，P2X7抗體染色后T組海馬和大腦皮質P2X7陽性細胞顯著少于C 組，說明有氧運動能夠降低大鼠海馬和大腦皮質中P2X7 受體的表達，提示P2X7 受體可能是有氧運動保護中樞神經系統功能的一個靶點。

P2X7 受體調控非選擇性Ca2+通道，從而介導K+、Na+及Ca2+的通透性變化。它可以介導Na+和Ca2+內流以及K+外流，并激活NF-κB和MAPK等多條信號通路，誘導IL-1β、IL-6 和TNF-α的生成[23-24]。NF-κB 在哺乳動物細胞中是一種重要的轉錄因子，可以綁定各種細胞基因啟動子和增強子序列，通過控制許多重要的細胞因子、粘附分子和趨化因子，在免疫反應、炎癥反應以及細胞生長調控中起著重要作用，參與細胞增殖和凋亡過程[25-27]。NF-κB p65是NF-κB 通路中一個重要的轉錄子，可與基因啟動子或增強子特異性結合啟動轉錄，NF-κB p65 蛋白由胞漿向核轉移是NF-κB 信號通路激活的關鍵點[28]。NF-κB 的激活需要P2X7 受體介導的信號轉導，嘌呤能信號通過P2X7受體選擇性靶向激活NF-κB[29]。細胞外ATP 可通過P2X7R-NFκB（p65）途徑促進炎性細胞因子釋放，已有研究表明，P2X7 激動劑可激活NF-κB p65 信號通路，而使用P2X7抑制劑則會抑制p65的表達，說明P2X7受體參與NF-κB信號通路的調控[30-31]。研究顯示，適當強度的有氧耐力訓練可以避免中樞神經系統細胞受到各種應激損傷，可通過抑制NF-κB 的活化發揮對阿爾茲海默病大鼠大腦的保護作用[32-33]。MAPK 信號通路調節包括p38、ERK 和JNK 在內的基因的表達，這些基因與免疫和炎癥反應相關，p38的激活會導致caspase-3的產生，并最終導致細胞死亡[34]。有研究證實，抑制P2X7 和MAPKs在帕金森和腦出血模型中提供了顯著的神經保護作用[35-36]。P2X7可以介導p38MAPK 的磷酸化，激活JNK信號通路，P2X7拮抗劑能夠通過阻斷p38MAPK的磷酸化抑制細胞凋亡，從而起到神經保護功能[37-38]。本實驗結果發現，4周跑臺有氧訓練后，大鼠海馬、大腦皮質組織p65 蛋白表達水平較對照組均顯著下降；各組大鼠海馬和大腦皮質中P38、JNK 無顯著差異，改變體現在其磷酸化水平，T組大鼠p-P38和p-JNK的表達較C組相比顯著下降。這表明有氧運動在抑制P2X7受體表達的同時，能夠降低大鼠海馬、大腦皮質p65 的表達，抑制P38和JNK蛋白的磷酸化，從而抑制NF-κB以及MAPK 信號通路。此外，P2X7 受體參與調節炎性因子的分泌，NF-κB 的激活也常伴有炎癥細胞聚集以及未成熟炎癥細胞因子IL-1、IL-6 和TNF-α 的合成，抑制或敲除P2X7受體可有效阻斷IL-1β等炎癥因子的產生[4]。本研究也發現，與對照組相比，訓練組大鼠海馬和大腦皮質中炎癥因子TNF-α、IL-1β以及IL-6 的表達水平均顯著下降，說明有氧運動可能通過抑制大鼠海馬和大腦皮質P2X7受體的產生，減少炎癥因子的表達，發揮對中樞神經系統的保護作用。

4 結論

有氧運動通過降低大鼠海馬和大腦皮質P2X7 受體的表達，抑制了p65、P38、JNK信號通路，減少了炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放，這可能是其保護中樞神經系統功能的機制之一。