直腸癌新輔助放化療反應的預測性分子標志物研究進展

黃棟 杜金林

根據2014年中國惡性腫瘤發病和死亡分析統計，我國結直腸癌發病率（27.08%）位于第三，死亡率（13.13%）位于第五［1］。直腸癌發病率約占結直腸癌總發病率的1/2，且以中低位直腸癌為主，中晚期直腸癌居多［2］。目前局部進展期直腸癌的標準治療方案是新輔助放化療后的根治性手術。

雖然新輔助放化療可以提高中低位直腸癌的可切除性，但不同患者新輔助放化療治療的結果從完全緩解到無腫瘤退行不等，因此，在新輔助放化療前確定那些對新輔助放化療治療不敏感的患者至關重要，而在新輔助治療之前確定預測性的分子生物標志物，對那些對新輔助放化療治療不敏感的患者極為重要。

生物標志物的定義是“作為正常生物過程、致病過程或對治療干預的藥理學反應的指標而被客觀測量和評估的特征”。理想的生物標志物應具有足夠的敏感性、特異性，并與疾病的嚴重程度相關。關于新輔助放化療療效的評估，文獻中多以TRG分級系統進行評估，在臨床實踐中最常見的四種 TRG 分級系統是由 Mandard 等［3］，Dworak等［4］，Wheeler等［5］和Ryan等［6］（表1）提出的。在這篇綜述中，我們總結了近年來基于組織和血液的分子生物標志物研究在預測直腸癌新輔助放化療反應方面的進展。包括研究生物標志物與新輔助放化療反應以及長期預后（如OS和DFS）之間的關聯。

表1 最常用的腫瘤退化分級（tumor regression grade，TRG）系統

一、血液中的生物標記物

1.蛋白質和代謝物

癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是CRC中被廣泛認可的預后和疾病監測的生物標志物，CEA與新輔助放化療療效的關系已被深入研究。雖然一半以上的研究使用5 ng/mL作為CEA的截斷值，但尚未有CEA升高的有效截斷值具有足夠的敏感性和特異性。有研究將新輔助放化療前血清CEA濃度≤5.33 ng/mL作為預測直腸癌新輔助放化療敏感的指標［7］。Song等［8］研究了674例接受新輔助放化療治療的局部進展期直腸癌患者的資料，發現新輔助放化療后CEA水平、新輔助放化療前后CEA比值與腫瘤降期顯著相關。Dudani等［9］的研究發現新輔助放化療前CEA升高是無病生存期（disease-free survival，DFS），短期總生存期（overall survival，OS）和病理完全緩解（pathologic complete response，pCR）的獨立預測因子。

端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）是端粒酶復合物的催化蛋白，利用端粒酶內部RNA模板（TR）合成新端粒序列，延長真核染色體末端的端粒，從而防止細胞衰老和死亡。Rampazzo等［10］的研究表明TERT水平的低表達以及新輔助放化療前后的TERT水平差異與新輔助放化療治療反應相關。

2.循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTCs）

CTCs是一種實時的生物標志物，在預測及篩選對新輔助放化療治療敏感或抵抗的患者方面表現出良好的前景［11］。多項研究發現，對新輔助放化療敏感者在新輔助放化療后采集的血樣中的CTCs相對于不敏感者顯著下降［11-13］。

3.宿主免疫反應

近年來，越來越多的證據表明，在腎細胞癌、肝細胞癌、胃癌和食管癌等實體腫瘤中，局部和全身炎癥反應與不良預后相關。這種與腫瘤相關的炎癥反應可以通過血液學參數反映出來。其中，中性粒細胞與淋巴細胞的比值（NLR）升高的被證明是pCR較差的預測因子［14-15］。也有多項研究表明新輔助放化療前的高水平白細胞計數與較差的治療反應相關。Xiao等［16］則發現腫瘤浸潤細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）和淋巴細胞比率（lymphocyte ratio，LYMR）是pCR的獨立預測因子。

4.血管內生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）

VEGF在腫瘤放療的微環境中有重要作用。Yu等［17］測定了31例局部進展中至低位直腸癌患者在接受新輔助放化療前的腫瘤標本的5個生物標志物（VEGF，PD-L1，DAXX，p-STAT3，EGFR）與新輔助放化療敏感性的相關性。發現只有VEGF表現為顯著的獨立預測因子。

5.血小板計數

在臨床觀察中，我們會發現不同類型的腫瘤中，血小板增高常與不良預后相關。Belluco等［18］將血小板計數300×109/L作為截斷值進行研究。發現在接受新輔助放化療治療的直腸癌患者中，治療前高的血小板計數是一個消極的預后因素。但是目前仍然很難定義一個最佳的血小板計數截斷值。

6.循環腫瘤基因（ctDNA）

循環腫瘤基因是腫瘤細胞體細胞DNA經脫落或者當細胞凋亡后釋放進入循環系統，是一種特征性的腫瘤生物標記，是一種可以準確反映腫瘤負荷的實時監測指標。Zhou等［19］發現ctDNA突變的中位變異等位基因頻率（variant allele frequency，VAF）是無轉移生存期的強獨立預測因子。

7.FOX轉錄因子家族

FOX蛋白是一類從酵母到人類都廣泛存在的轉錄因子。FOX家族蛋白功能涉及胚胎發育、細胞周期調控、糖類、脂類代謝、生物老化及免疫調節等多種生物學過程，其突變和表達異常與發育畸形代謝性疾病以及腫瘤發生有關［20］。Zhang等［21］通過數據庫分析發現FOXK1和FOXK2的過表達與新輔助放化療后較差的預后相關。

二、腫瘤組織中的分子生物標記物

1.DNA突變和DNA甲基化

目前有許多研究人員將基因型生物標志物作為新輔助放化療pCR的潛在預測因子。一項研究發現對新輔助放化療反應差的直腸癌相對與有良好反應的直腸癌更容易同時發生KRAS和TP53突變（KP基因型）［22］。Wan等［23］發現8號染色體≥5個拷貝和CTCs中ARID1A，HDAC1，APC，ERBB3，TP53，AMER1，AR的8個非同義突變與pCR相關。

DNA甲基化被認為是參與調控基因表達的重要表觀遺傳機制，并且基于DNA甲基化的生物標記物被認為是用于癌癥診斷和預后的有用工具。Canto等［24］對直腸癌和正常組織樣本進行全基因組DNA甲基化分析發現完全病理緩解患者腫瘤中高甲基化探針相對于不完全病理緩解的患者比例較高。

2.MicroRNA

MicroRNA（miRNA）是一種高度保守的小的非編碼RNA，長度為18～25個核苷酸，參與基因的表達后調控。Machackova等［25］發現miR-487a-3p與不完全緩解密切相關。Cristóbal等［26］證明mir-199b的表達與新輔助放化療療效有關。Du等［27］研究發現miR-548c-5p、miR-548d-5p和miR-663a與新輔助放化療后的完全緩解顯著相關。Campayo等［28］發現miR-21、miR-99b和miR-375組合可預測新輔助放化療后的完全緩解與否。

3.長鏈非編碼RNA（lncRNA）

lncRNA是長度為＞200個堿基對的RNA，在基因表達、蛋白表達和染色質狀態等多種生物學功能中發揮重要作用。Yokoyama等［29］的研究提示lncRNA中的H19和UCA1可能參與了對5-FU的易感性，進而與對新輔助放化療的敏感性相關。

4.基因表達譜

腫瘤組織的整體基因表達譜有可能識別與新輔助放化療反應相關的基因信號。雖然研究的基因眾多，但目前發現主要與細胞增殖和凋亡［30-35］、腫瘤轉移［30-31］、細胞周期［32］、DNA修復［33，36］和細胞分化［36-37］相關（表2）。

表2 基因表達譜對結直腸癌新輔助放化療敏感性的預測

5.腫瘤免疫微環境

激活宿主免疫應答在放化療的治療效果中起著重要作用，同時它也可以激活免疫抑制途徑。在腫瘤免疫微環境的影響因素中，CD8+TIL被研究最多，多數研究認為新輔助放化療前較高的CD8+TIL與較差的病理反應和預后相關［22，38-39］。

6.微衛星不穩定性（microsatellite instability，MSI）

MSI是指由于在DNA復制時插入或缺失突變引起的微衛星序列長度改變的現象，常由錯配修復（mismatch repair，MMR）功能缺陷引起，與癌癥發生有關，可用于癌癥檢測。Hasan等［40］的研究發現MSI（+）是一個降低病理完全緩解的獨立預測因子。

7.DNA修復基因

基因組完整性的維持對正常細胞增殖和存活是至關重要的。而DNA修復失敗將會導致基因組不穩定和癌癥。因此DNA修復基因的表達失調很有可能會產生對新輔助放化療的不良反應。Jimenez等［41］的研究提示DNA修復基因表達差的患者更易產生對新輔助放化療的不良反應。

三、單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNPs）

SNPs主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。Peng等［42］發現SNP中PTEN：rs12569998與對新輔助放化療的反應顯著相關，PTEN雜合子：rs12569998對新輔助放化療的反應優于野生型基因型，AKT2：rs8100018與5年無病生存率（DFS）相關。AKT2雜合子：rs8100018患者復發風險降低，5年無病生存率優于野生型基因型患者，但還沒有發現有SNP與pCR顯著相關［42］。

四、印戒細胞癌（signet-ring cell carcinoma）

印戒細胞癌是一種含有大量黏液的癌細胞，黏液把細胞核擠向細胞的一側，其惡性程度高，預后較差。有研究發現新輔助放化療前的活檢樣本中的印戒細胞成分與較好的新輔助放化療反應顯著相關，然而，關于印戒細胞癌對新輔助放化療療效的預測價值，目前還缺乏相關數據［43］。

五、小結與展望

盡管新輔助放化療在直腸癌中的應用已十余年，但我們目前仍缺乏在治療前或治療早期區分對新輔助放化療耐藥患者和敏感患者的能力，從而指導對治療方案的適應性修改。雖然目前已經提出了許多分子生物標記物作為新輔助放化療反應的預測指標，然而還沒有一個達到臨床標準。而在直腸癌中缺乏預測新輔助放化療的生物標志物可歸因于分子生物標志物研究方法上的幾個問題。

首先，大多數研究只評估了一種類型的生物標記物，而沒有評估它們相對于其他標記物的性能，并且它們自身的敏感性和特異性也不夠。因此，有必要比較和整合多種不同的生物標記物（包括臨床病理和影像學特征），以對比它們之間的性能，從而開發出一種最佳的、可靠的生物標志物模型，能夠更準確地預測對新輔助放化療的反應的生物標志物模型。

第二，結直腸癌是一種高度異質性的疾病。并且一些研究表明CRC具有較高的腫瘤內異質性［44］?；谶@些發現，單一的生物標志物不太可能達到足夠的敏感性和特異性來預測不同患者對新輔助放化療的敏感性，因此研究生物標記物和腫瘤生物學之間的聯系機制，增加生物標記物及其潛在局限性的大量信息，對我們能夠選擇與特定疾病亞型最相關的分子生物標記物極為重要。

第三，使用不同的TRG系統也可能是研究中的潛在偏差。在本文所述的研究中使用了各種TRG系統。包括Mandard等［3］，Dworak等［4］，Wheeler等［5］和Ryan等［6］提出的四種TRG系統。這些臨床變異性可能會增加統計分析所需的樣本數量，影響得出明確結論。因此，今后的研究應嚴格設計有足夠數量的樣本，遵循相同的新輔助放化療方案和標準化的腫瘤應答評價系統。

總之，盡管沒有預測分子生物標志物對新輔助放化療有足夠的臨床效用，但是整合不同類型的生物標志物包括臨床病理和影像學特性，以及腫瘤生物學的聯系機制的認識或許可以開發出一種最佳的、可靠的生物標志物模型，能夠更準確地預測對新輔助放化療的反應。