晚期糖基化終末產物對大鼠雪旺細胞增殖和凋亡影響的體外研究

羅娜，王琦，楊文強，于炎冰，張黎

雪旺細胞(Schwanncells，SCs)是周圍神經系統的膠質細胞，起源于神經嵴細胞，能分化成髓鞘細胞；其在髓鞘的形成和修復、維持髓鞘的厚度和絕緣性中起著重要作用[1]。此外雪旺細胞還能分泌各類神經營養因子[2]，促進軸突的生長，在神經發育和再生等過程中發揮重要作用。糖尿病持續的高血糖會導致雪旺細胞的線粒體功能障礙[3]，凋亡增加，導致髓鞘損傷和脫髓鞘；這可能是糖尿病周圍神經病變的一個重要機制[4]。

糖尿病周圍神經病(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常見的并發癥，其發病機制尚未完全明確。研究顯示強化血糖控制或胰腺移植并不能減少2型糖尿病DPN的發生[5-6]，表明神經病變在高血糖早期已經發生。長期的高血糖導致多元醇途徑激活，氧化應激和線粒體功能障礙以及晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)[7]形成。過量的AGEs激活了晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)，導致細胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)形成，細胞氧化損傷；此外AGEs和RAGE的結合誘導氧化應激，從而導致核因子NF-κβ及其相關促炎基因的上調，引起神經功能障礙和疼痛[8-9]。雪旺細胞中RAGE過度表達與DPN的發生有關；AGEs引起關鍵蛋白(如膠原蛋白)、脂質和核酸的修飾有可能改變雪旺細胞的結構和功能，進而影響其包裹的軸突，導致DPN的進一步發展。因此，探討AGEs導致雪旺細胞損傷的機制對DPN的防治有著重要意義。本研究體外培養了大鼠雪旺細胞，予以不同濃度的AGEs刺激，觀察其對雪旺細胞增殖和凋亡的影響及相關蛋白表達水平的改變。

1 材料與方法

1.1 材料 RSC-96細胞(中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心)；DMEM-H培養基，FBS，0.25%胰蛋白酶，青鏈霉素雙抗(美國Gibco公司)；CCK-8試劑盒(中國凱基公司)；Caspase-3檢測試劑盒，TUNEL檢測試劑盒，DAPI染液(中國碧云天公司)；p-Akt抗體，Akt抗體，p-GSK3β抗體，GSK3β抗體，β-Actin抗體，β-Tubulin抗體(美國CST公司)；Bcl-2抗體，BAD抗體，CHOP抗體，GRP78抗體(美國Proteintech公司)；兔二抗(中國碧云天公司)，山羊二抗(中國普利萊公司)；AGE-BSA(英國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理 將RSC-96細胞加入DMEM完全培養基(含10% FBS、1%雙抗)，置于37 ℃、5% CO2、95%飽和濕度培養箱中傳代培養；按1∶2～1∶6傳代，每2～3 d換液1次。細胞傳代后，培養24 h后給予AGEs刺激，將AGEs直接溶于培養基后按照不同的濃度刺激細胞，培養一段時間后繼續后續的操作。

1.2.2 細胞活力測定 將RSC-96細胞以2.0×104個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，每組6個復孔。用DMEM完全培養基培養24 h后，更換低血清DMEM培養基(含2% FBS，1%雙抗)。用0、100、250、500、1 000 μg/mL濃度AGEs處理RSC-96細胞(0 μg/mL AGEs組為對照組)，刺激24 h、48 h、72 h后檢測細胞的存活率。向每孔細胞加入10 μL CCK-8工作液，放回培養箱繼續培養1～2 h；待培養基變成橙色后，用酶標儀檢測各孔細胞在450 nm處的吸光度，即OD值。將各孔細胞的OD值減去空白OD值(培養基加CCK-8檢測液，無細胞)，取各孔細胞平均OD值，細胞存活率=(加藥細胞OD值/對照細胞OD值)×100%。

1.2.3 Caspase-3活力測定 將RSC-96細胞以1.5×105個/mL接種于12孔板，每孔1 mL，每組4個復孔；用DMEM完全培養基培養24 h后，更換低血清DMEM培養基。用0、100和500 μg/mL濃度的AGEs處理RSC-96細胞48 h后，檢測其Caspase-3活力。用胰酶將貼壁細胞消化下來，600 g、4 ℃離心5 min收集細胞，小心吸除上清，PBS清洗1次后，加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min。每組細胞取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度，再取50 μL樣品用于檢測ρNA(ρ-nitroaniline)。每組樣品中加入40 μL緩沖液和10 μL Ac-DEVD-ρNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp ρ-nitroanilide)，空白對照用50 μL裂解液代替蛋白樣品，混勻后37 ℃孵育1～2 h，顏色明顯變黃后測定樣品的OD值。將各孔細胞的OD值減去空白對照的OD值，取各孔細胞平均OD值，Caspase-3活力=(實驗組OD值/對照組OD值)×(對照組蛋白濃度/實驗組蛋白濃度)×100%。

1.2.4 細胞凋亡檢測 將RSC-96細胞以1.5×105個/mL接種于24孔板(內含細胞爬片)，每孔0.5 mL，每組3個復孔。用DMEM完全培養基培養24 h后，更換低血清DMEM培養基，用0、100和500 μg/mL濃度的AGEs處理RSC-96細胞72 h后，檢測細胞凋亡。貼壁細胞用PBS洗一遍后加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗一遍后加入通透液(含0.3% Triton X-100的PBS)室溫孵育5 min。按說明書配置TUNEL檢測液，細胞用PBS洗滌兩次后加入50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗3次后加入DAPI染色液，室溫避光孵育10 min。洗去DAPI染色液后用抗熒光猝滅封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察、拍照，用ImageJ軟件分析結果；計算凋亡指數(凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數×100%)。

1.2.5 細胞蛋白檢測 采用免疫印跡法。將RSC-96細胞以1.5×105個/mL接種于6孔板，用DMEM完全培養基培養24 h后，更換低血清DMEM培養基。用0、100和500 μg/mL濃度的AGEs處理RSC-96細胞72 h后，提取細胞總蛋白。根據蛋白濃度算出每組樣品體積，將蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液按5∶1混勻后100 ℃加熱5 min。將蛋白樣品混合物和蛋白Maker加入10% SDS-PAGE凝膠內，以150 V恒壓電泳60 min。然后取出凝膠，以250 mA恒定電流濕轉60 min，用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h。用一抗稀釋液稀釋一抗，將PVDF膜在稀釋的一抗中4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min；用二抗稀釋液稀釋二抗，將PVDF膜在稀釋的二抗中室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min；將ECL顯影液按A液與B液1∶1配好后，將膜在顯影液中避光孵育30～60 s，然后放入成像系統，曝光成像。用Image J軟件分析目標條帶的灰度值，以內參的灰度值作為內部對照。

2 結 果

2.1 AGEs對RSC-96細胞增殖的影響 與對照組細胞相比，培養24 h、48 h時各濃度AGEs組RSC-96細胞的活力無顯著下降；但培養72 h時，各濃度AGEs組RSC-96細胞的活力均明顯降低(均P<0.05)(圖1)；表明AGEs處理72 h后RSC-96細胞的增殖能力減弱。

與Control組比較*P<0.05圖1 不同濃度AGEs組RSC-96細胞培養24～72 h相對活力變化

2.2 AGEs對RSC-96細胞凋亡的影響

2.2.1 AGEs組與對照組RSC-96細胞Caspase-3活性比較 與對照組相比，100 μg/mL和500 μg/mL AGEs組RSC-96細胞的Caspase-3活性均明顯增強(均P<0.05)。見圖2。

與Control組比較*P<0.05圖2 不同濃度AGEs組與對照組RSC-96細胞Caspase-3活性比較

2.2.2 AGEs組與對照組RSC-96細胞凋亡指數比較 隨著AGEs濃度的增加，凋亡細胞(綠色熒光標記陽性細胞)數增多(圖3)。與對照組相比，100 μg/mL和500 μg/mL AGEs組RSC-96細胞的凋亡指數均明顯增高(均P<0.05)(圖4)。

2.3 AGEs對RSC-96細胞Akt通路的影響 與對照組相比，100 μg/mL和500 μg/mL AGEs組RSC-96細胞的P-Akt、p-GSK3β蛋白水平明顯降低；p-Akt/Akt和p-GSK3β/GSK3β明顯降低。表明其Akt和GSK3β磷酸化受到了抑制，AGEs可以抑制RSC-96細胞Akt通路的激活。見圖5-7。

2.4 AGEs對RSC-96細胞凋亡蛋白表達的影響 與對照組相比，100 μg/mL和500 μg/mL AGEs組RSC-96細胞的BAD蛋白表達水平升高，而Bcl-2蛋白表達水平降低(圖8)；表明AGEs可以促進RSC-96細胞促凋亡蛋白的表達，抑制RSC-96細胞抑凋亡蛋白的表達。

2.5 AGEs對RSC-96細胞內質網應激的影響 與對照組相比，100 μg/mL和500 μg/mL AGEs組RSC-96細胞的CHOP蛋白表達水平升高，而GRP78蛋白表達水平降低(圖9)；表明AGEs導致了RSC-96細胞的內質網應激增強且處于內質網應激晚期失代償。

圖3 各組RSC-96細胞凋亡檢測結果(熒光染色，×100)

與Control組比較**P<0.05圖4 不同濃度AGEs組與對照組RSC-96細胞凋亡指數比較圖5 各組RSC-96細胞Akt通路蛋白免疫印跡檢測

與Control組比較**P<0.05圖6 不同濃度AGEs組與對照組RSC-96細胞p-Akt/Akt蛋白水平比較與Control組比較**P<0.05圖7 不同濃度AGEs組與對照組RSC-96細胞p-GSK3β/GSK3β比較圖8 各組RSC-96細胞的BAD、Bcl-2蛋白表達水平

圖9 各組RSC-96細胞的CHOP、GRP78蛋白表達水平

3 討 論

中國糖尿病患者呈快速增長趨勢，糖尿病前期患者的比例也很高，超過半數的糖尿病患者會發展成為DPN，嚴重影響患者生活質量[10]。臨床上對DPN的治療方法是控制血糖和疼痛的對癥治療，尚無有效的藥物阻止DPN的發生。DPN發病機制十分復雜，尚未完全闡明。目前認為其與遺傳易感性、胰島素抵抗、高血糖、低度炎癥狀態、血管內皮細胞功能紊亂和凝血功能異常等多種因素有關。高血糖可導致多元醇途徑激活、AGEs形成增加、蛋白激酶C途徑激活以及己胺糖通路激活等。高血糖時線粒體電子傳遞鏈過氧化物產生過量引起氧化應激是以上各種途徑的共同機制。因此，研究DPN的病理機制對于尋找延緩DPN進展的關鍵藥物意義重大。

高血糖導致過量的AGEs累積是DPN的重要發病機制，AGEs的形成和累積與糖尿病的進展呈正相關。研究發現，AGEs在糖尿病患者和實驗動物的周圍神經中積累，而抗糖基化藥物可以抑制AGEs的形成，改善實驗性糖尿病大鼠的神經病變[11-12]。AGEs由賴氨酸側鏈和大分子(氨基酸、蛋白質、磷脂和核酸)末端氨基還原碳水化合物的非酶反應(糖基化反應)生成，這個過程開始形成可逆的希夫堿，然后得到更穩定的早期糖基化產物，經過進一步的復雜反應，如重排、脫水和縮合，生成了不可逆的交聯熒光蛋白衍生物，稱為AGEs[13]。機體組織中AGEs累積會對蛋白質、脂類和DNA的功能產生不利影響，誘發炎癥和活性氧濃度的升高，最終影響細胞代謝活動；這些因素進一步導致AGEs累積，引起機體疾病如糖尿病、炎癥、心血管疾病和神經退行性疾病[8,14-15]。在血管壁中AGEs可激活細胞內信號轉導通路，從而引起生長因子、細胞粘附分子及細胞因子表達增加，抑制細胞復制并誘導細胞凋亡[16]。然而，AGEs在DPN中的作用機制尚不清楚。

AGEs有許多不同的來源，葡萄糖通過糖基化、自氧化和其他代謝途徑形成免疫化學性質不同的AGEs。由早期糖基化產物(amadori product)分解產生的、甘油醛(糖酵解中間產物)產生的、乙醇醛(希夫堿分解產物)產生的、甲基乙二醛(甘油醛和糖基化產物分解產物)產生的和葡萄糖自氧化產生的AGEs分別命名為AGE-1～5[17]。這5種AGEs抗體均能在糖尿病患者的血液中檢測到[18]。這些不同的內源性AGEs對神經元、視網膜細胞和腎細胞有不同的生物學效應[19]；AGE-2(甘油醛衍生的AGEs)能促進神經元的凋亡[17]；AGE-2和AGE-3(乙醇醛衍生的AGEs)能顯著抑制SCs的復制，誘導其凋亡；而AGE-1(葡萄糖衍生的AGEs)對SCs的增殖和凋亡無明顯影響[20]。研究還發現AGE-2和AGE-3能促進 SCs核因子NF-κβ的活化以及TNF-α和IL-1β的分泌，還能導致細胞氧化應激增強和線粒體功能障礙。本研究采用Abcam公司的AGEs，由BSA與乙醇醛發生反應得到的AGE-BSA進行細胞實驗；結果表明AGEs以劑量和時間依賴性方式影響RSC-96細胞的存活，增強細胞Caspase-3活性，導致細胞的凋亡數明顯增加。由此推測AGEs直接導致了雪旺細胞的凋亡，進而引起神經脫髓鞘和周圍神經再生受損；這可能是高血糖引起周圍神經病變的重要機制。

Akt是細胞存活的重要調節因子，可以抑制細胞凋亡。Akt激活后會磷酸化其下游的調節蛋白，最著名的是GSK3，還包括雷帕霉素(mTOR)、TSC2、caspase-9和PRAS40 (AKT1S1)。Akt在促進細胞增殖、分化、凋亡、血管生成和代謝等方面具有相對廣泛的下游效應[21]，參與葡萄糖代謝和儲存的糖原合酶受GSK3和其他幾種下游蛋白的調控；此外，mTORC1通過固醇反應元件結合蛋白(SREBP)轉錄因子調節脂質代謝；這些因素通過防止蛋白質分解來促進細胞生長，通過激活核苷酸合成來刺激細胞增殖，并在不同情況下調節細胞自噬[22]。因此可以推斷，Akt信號傳導途徑在糖尿病及其相關并發癥、癌癥的發生和進展、損傷、修復和重塑等過程中起到至關重要的作用。研究發現Akt在周圍神經系統軸突包裹和髓鞘厚度調節中起關鍵作用[23]；糖尿病及其并發癥的發展受到Akt信號通路的調節[24-25]。動物實驗研究發現，DPN大鼠的背根神經節和坐骨神經中Akt的激活受到了抑制[26-27]；在細胞實驗中，藥物激活Akt信號通路可以保護細胞免受高糖和氧化應激等造成的細胞損傷[28-29]；這給尋找神經營養藥物一些提示。相反，抑制Akt的激活可以導致細胞的凋亡[30]，這可能成為癌癥治療的一個靶點。本研究觀察到AGEs處理的RSC-96細胞，磷酸化的Akt-Sre473和磷酸化的GSK3β-Ser21/9的表達水平降低，表明Akt信號通路受到了抑制。

Bcl-2和BAD是Akt/GSK3β信號通路的下游調節蛋白，Bcl-2可抑制細胞凋亡，BAD則促進細胞凋亡[25]。本研究中， AGEs處理的RSC-96細胞中Bcl-2表達水平降低，而BAD表達水平增高；提示AGEs可能通過阻斷Akt/GSK3β信號通路，影響其下游凋亡相關蛋白的表達來誘導凋亡。在內質網應激的3種主要信號通路中，PERK (protein kinase RNA-like ER kinase)/CHOP(CCAT-enhancer-binding protein homologous protein)通路被認為與細胞凋亡密切相關。內質網應激的早期階段是一種旨在維持內質網穩態的適應性反應，被稱為未折疊蛋白反應(unfolded protein reaction，UPR)，由葡萄糖調節蛋白78(glucose regulatory protein 78，GRP78)和內質網伴侶蛋白調控；PERK信號通路發生在內質網應激早期，通過抑制蛋白質的合成對細胞起保護作用，促進細胞的生存；如內質網應激長期存在，可誘導細胞凋亡的內在途徑[31]；PERK通過誘導CHOP的表達而促進細胞凋亡，CHOP可抑制Bcl-2的表達，增加活化Caspase-3的表達水平，導致細胞死亡。GRP78在內質網應激早期表達增多，而在晚期則表達減少。在本研究中，AGEs刺激后的RSC-96細胞GRP78蛋白水平降低，而CHOP蛋白水平升高，Caspase-3的表達水平增加；表明AGEs造成了RSC-96細胞的內質網應激，且處于內質網應激晚期。

有研究認為Akt激活可以減輕內質網應激[32]，Akt失活則導致內質網應激[33]。也有研究發現，CHOP抑制Akt的激活，而GRP78則增強Akt的激活，促進細胞存活[34-35]。本研究推測Akt信號通路和內質網應激通路相互作用，互相影響。通過激活Akt、抑制內質網應激可以促進細胞的存活，這為在高血糖和氧化應激狀態下保護神經、減少雪旺細胞凋亡提供了很好的方法。本研究通過AGEs刺激大鼠雪旺細胞實驗發現了DPN可能的機制，即AGEs通過抑制Akt的激活，增強內質網應激導致雪旺細胞的凋亡；結果提示可以通過尋找激活Akt或抑制內質網應激的藥物減緩DPN的進展。