澳洲和牛超數排卵與體內胚胎生產的影響因素研究

趙善江，隋鶴鳴，郝海生，胡智輝，龐云渭，鄒惠影，杜衛華，趙學明，朱化彬*

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，農業農村部動物遺傳育種與繁殖(家禽)重點實驗室，北京 100193；2.全國畜牧總站，北京 100125)

澳洲和牛(Australian Wagyu beef)原產于日本，是世界公認的適合生產優質高檔雪花牛肉的理想肉牛品種[1]。據統計，日本和牛年飼養量高達180萬頭，可以滿足1億人對于雪花牛肉的消費需求。目前，雖然日本政府全面禁止和牛遺傳物質(包括活牛、精液和胚胎)出口，但是美國和澳大利亞等國家之前已經進口了相當數量的純種和牛。近年來，隨著我國消費優質高檔雪花牛肉人群的不斷增加，國內一些企業先后從澳大利亞引進了純種和牛胚胎和活牛[2-4]。但是，牛是單胎動物，每年通常只能成功繁殖1頭犢牛，加之規?；A母牛繁育場成本高，肉牛繁殖率低等原因，應用本交或人工授精的常規繁殖方法無法滿足生產者快速建立核心群以及消費者對高檔和牛肉的需要。

超數排卵-胚胎移植(multiple ovulation and embryo transfer，MOET)是快速擴繁良種牛的重要技術途徑，MOET可在較短時間內獲得大量的優質胚胎用于移植，因此，該技術可以快速、高效地挖掘與傳播優良肉牛品種的優秀基因，從而最大程度地擴繁優秀家畜。據國際胚胎移植協會統計，2018年世界范圍共利用外源促性腺激素超排供體母牛76 076萬頭，獲得可用胚胎469 967萬枚，頭均6.2枚·次-1[5]。因此，MOET技術仍是優秀家畜快速擴繁的重要技術手段，相信未來在我國自主肉牛品種培育和擴繁中仍將發揮重要的作用[6]。

實際生產中，供體牛的超排效果受多種因素的影響，例如供體牛類型、超排次數以及激素劑量等均是影響供體牛超排效果的重要因素[4, 7-12]。此外，MOET技術在奶牛和一些主要肉牛品種中應用比較廣泛[13-14]。但是，國內關于澳洲和牛超數排卵方面的研究較少，僅見畢江華等[9]研究了超數排卵次數對和牛體內胚胎生產的影響，隋鶴鳴等[4]研究了不同FSH劑量對和牛胚胎移植后代超數排卵效果的影響，趙明禮等[11]研究了超排前卵巢上的有腔卵泡數量多少對青年和牛體內胚胎生產效率的影響，但是上述研究的內容較為單一，且部分研究的試驗動物頭數少(n=9)。因此，本試驗從不同供體牛類型、同期發情方法、FSH劑量以及超排次數等多角度研究其對澳洲和牛供體牛超排和胚胎生產效率的影響，旨在為澳洲和牛優質體內胚胎的生產以及核心生產群的快速建立提供一定的應用參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

供體母牛為華北地區某純種和牛良繁場提供的16～22月齡純種青年和牛和產犢后90 d以上的純種經產和牛母牛，所有牛只系譜信息完整，生殖器官正常，發情周期正常。精液為山東奧克斯畜牧種業有限公司同批次生產，經鏡下抽檢計數，精液活力≥35%，符合國標《牛冷凍精液》(GB 4143—2008)的質量要求。試驗地點為華北地區的某純種和牛繁育場，試驗時間為4～8月份。

1.2 試驗材料和試劑

促卵泡激素(FSH，Folltropin-V，稀釋后20 mL·瓶-1，含NIH-FSH-P1 20 mg· mL-1，Bioniche公司生產)、孕酮陰道栓(CIDR，1.56 g孕酮·支-1，Vetoquinol公司生產)、氯前列腺稀醇(PG，0.322 mg·mL-1，齊魯動物保健品公司生產)，保存液、沖胚液均由Bioniche公司生產。

1.3 試驗設計

根據供體牛的選擇條件，挑選符合條件的健康供體母牛。將供體牛按照發育生理階段分為青年牛和經產牛兩組，其中青年牛38頭，經產牛42頭。青年牛和經產牛兩組內均設置不同的同期發情方法組、FSH劑量組以及超排次數組。

1.3.1 同期發情處理方法 根據同期方法把青年牛和經產牛的超排前同期處理分為埋置CIDR組和PG注射組，自然發情為對照組。CIDR組即在供體和牛發情周期的任意一天上午陰道埋植CIDR(埋植當天計為第0天)，并補充注射2支維生素ADE(每支5 mL)，埋置CIDR后第5天開始超數排卵處理；PG注射組即給直腸觸診檢查卵巢上存在黃體的供體母牛肌肉注射PG 6 mL，注射后48～72 h 內每天早、晚兩次觀察供體母牛發情情況(發情當天計為第0天)，發情后的第9～10天開始超排處理；對照組為自然發情組，觀察到供體母牛發情當天計為第0天，發情后的第9～10天開始超排處理。

1.3.2 超排處理及人工授精 根據不同同情方法分別在CIDR埋置后第5～8天或觀察到發情后第9～12天 開始超數排卵處理，每天07:00、19:00分兩次 肌肉注射FSH，連續注射4 d，第5和第6次注射FSH的同時各注射1 支PG(0.6 mg)，并于第6次注射FSH后撤出CIDR。第9天觀察發情，觀察到供體牛發情后的8～12 h進行第1次人工輸精，使用1支細管凍精，間隔12 h 后進行第2次人工授精，使用2支 細管凍精。每天早、晚兩次觀察供體母牛自然發情情況并記錄。青年牛FSH劑量分為120、200和220 mg 3組，經產牛FSH劑量分為220、230、240、250 mg 4組。

1.3.3 供體胚胎采集與質量鑒定 采用非手術方法于第1次人工輸精后的第7天(發情當天為第0天)回收胚胎。供體母牛保定后，尾椎硬膜外腔注射5～7 mL利多卡因局麻，待尾部松弛后清除宿糞，高錳酸鉀水消毒外陰后，用消毒紙巾擦凈，然后用75%酒精消毒并用生理鹽水沖洗2遍。選擇德國(Minitub)15#采胚管回收沖胚，每次注射20～30 mL 沖卵液到子宮并回收。每頭供體牛每側子宮角約使用120～160 mL沖胚液，胚胎回收后肌肉注射PG。胚胎收集在集卵杯中，使用體視顯微鏡進行檢胚。根據國標《牛胚胎》(GB/T25881—2010)的形態學鑒定標準，將回收胚胎分為A、B、C(可用胚胎)、D(退化胚胎和未受精卵，不可用胚胎)級胚胎。

1.3.4 測定指標 記錄統計不同試驗組間供體牛FSH注射劑量、黃體數、回收胚胎數、可用胚胎數、A級優質胚胎數、不可用胚胎數、退化胚胎數、未受精數等指標。

1.4 統計分析

試驗數據采用“平均值±標準誤”表示，應用SAS 9.2軟件分別對不同供體類型、超排次數、FSH劑量和同期發情處理方法各組數據進行單因素方差分析及多重比較。P<0.05 表明組間差異顯著。

2 結 果

2.1 優質和牛超排情況分析

優質和牛超排情況見表1。結果表明，試驗共超排優秀和牛供體117頭，超排有效率(回收胚胎數或未受精卵數>2個的供體頭數占超排供體總頭數的百分比)為86.3%，獲得胚胎總數為1 183枚，其中，可用胚胎(含A、B、C三級胚胎)864枚，A級優質胚胎341枚，不可用胚胎(含未受精和退化胚胎)319枚。

表1 優質和牛超排情況一覽表

2.2 供體牛類型對優質和牛超排效果的影響

如表2所示，經產牛的超排有效率((95.46±2.58)%)顯著高于青年牛((77.55±6.02)%)(P<0.05)，胚胎總數(12.30vs10.40)、可用胚胎數(8.97vs7.66)、A級胚胎(3.86vs2.50)也明顯高于青年牛，但各組間均無顯著差異(P>0.05)。

表2 不同供體牛對超數排卵效果的影響

2.3 超排前不同同期方法對優質和牛超排效果的影響

如表3所示，自然發情、前列腺素同期發情和埋植CIDR同期發情的超排有效率分別為(88.89±11.11)%、(95.45±4.54)%和(85.71±3.84)%，自然發情組供體牛頭均可用胚胎總數((11.22±2.33)枚)顯著高于PG處理組((6.09±1.05)枚)(P<0.05)，其余各組間均無顯著差異(P>0.05)。

表3 超排前不同同期方法對和牛超排效果的影響

2.4 不同FSH劑量對優質和牛超排效果的影響

如表4所示，不同劑量FSH可顯著影響母牛超排效率，青年牛120 mg FSH組的超排有效率((55.56±17.57)%)顯著低于200 mg((88.00±6.63)%)和220 mg 組((73.33±11.82)%)(P<0.05)；不同FSH劑量對經產牛的不可用胚胎數影響顯著，經產牛220 mg 組的不可用胚胎數((2.28±0.65)枚)顯著低于250 mg組((5.00±1.38)枚)(P<0.05)。

表4 不同FSH劑量對和牛超排效果的影響

2.5 超排次數對優質和牛超排效果的影響

如表5所示，青年牛第一次超排有效率((70.27±7.62)%)顯著低于第二次超排有效率(100%)(P<0.05)，但是青年牛第二次超排回收A級優質胚胎數((1.42±0.39)枚)明顯低于第一次((2.25±0.40)枚)；經產牛方面，經產和牛第一次超排有效率((95.12±3.41)%)和第二次超排有效率((96.0±4.00)%)差異不顯著(P>0.05)，但經產牛第二次超排回收的不可用胚胎數((4.44±0.92)枚)顯著高于第一次超排((2.39±0.40)枚)(P<0.05)，此外，第二次回收A級優質胚胎數((2.88±0.69)枚)明顯低于第一次((4.17±0.80)枚)。橫向對比青年牛和經產牛發現，無論是第一次超排還是第二次超排，青年?；厥盏腁級優質胚胎總數均低于經產牛。

表5 超排次數對供體超排效果的影響

3 討 論

生產優質和牛胚胎進行移植是建立和牛核心生產群最快速的方法之一[15]。優質胚胎的生產一般分為體內和體外兩種模式，近年來，盡管借助于活體采卵的體外胚胎生產數量在不斷增加，然而，就目前國內現有的生產體系而言，體外胚胎生產仍存在生產效率低、冷凍效果差、胚胎移植妊娠率低等問題[16-18]。因此，應用穩定的體內胚胎生產體系生產和牛胚胎仍是不可替代的主要途徑之一。

在過去20多年里，MOET廣泛應用于奶牛等胚胎生產及國產化良種培育工作[19]，為中國荷斯坦奶牛等國產化自主品種的培育做出了重要貢獻[13]。但是，MOET效果受多種因素的影響，其不僅受供體牛自身生理狀態的影響，還受飼養管理水平、同期發情方法、激素濃度等因素的影響[7,20-22]，并且，國內對于MOET在優質純種和牛高效擴繁上的應用研究較少。

3.1 供體母牛類型對超數排卵效果的影響

供體母牛卵巢對外源FSH處理產生反應是母牛獲得良好超排效果的基礎[23]。生產中，供體母牛超排效果是根據直腸觸診卵巢上的黃體數量，以及非手術采卵獲得的胚胎或卵子數量來進行評價的[24]。正常情況下，每個發情周期母牛雙側卵巢最多各排出1個卵子和產生1個黃體，因此，當供體母牛超排后卵巢上黃體數量或者采集胚胎或卵子數量大于兩個時，認為對該供體牛的超排有效。本試驗研究結果表明，經產牛超排有效率顯著高于青年牛，且頭均胚胎總數、頭均可用胚胎數、頭均A級胚胎數等也明顯高于青年牛，這與Peippo等[25]的研究結果一致，這可能是因為青年牛的體重和體高雖然達到了適配要求，但是其生長發育尚未結束，尤其是乳腺和生殖器官還沒有發育成熟，導致卵巢對外源FSH處理的反應不好。此外，進一步對超排無效的青年供體牛分析發現，超排無效的青年牛中高達72.7%牛只(8/11)的體況評分都高于3.75(肥胖牛)，研究表明，體況也是影響超排效果的一個重要因素[26-27]，體況評分高的牛只卵巢上始基卵泡募集、發育遲緩，且血液循環對雌激素等消耗量更大，卵泡可能也需要發育到更大體積才有可能合成足量的雌激素來觸發LH峰從而排卵，這也導致卵巢對于FSH的反應不佳[28-29]。體況評分高的供體牛直腸內脂肪沉積也會過度，這會直接影響直腸把握的精度，進而造成胚胎回收效率低。此外，本試驗發現，青年牛子宮頸較為狹窄也是造成超排效率低的原因之一。本試驗中，有1頭青年供體牛因為采卵管無法通過子宮頸未進行沖卵，另外1頭采卵時沖卵液回收不好，這可能與月齡較小有關，而這些都會影響青年供體和牛的超排有效率。

3.2 FSH劑量對供體超數排卵效果的影響

外周循環血液中維持一定濃度FSH是誘發卵巢多個卵泡發育成熟并排卵的前提[30-31]，在一定范圍內，隨著FSH濃度的增加，供體牛卵巢黃體數和理論上可以回收的胚胎數也會隨之增加，但是當FSH濃度增加到一定閾值后，供體牛卵巢的反應會達到平臺期不再增加，如果繼續增加FSH濃度，則卵巢反應會迅速下降，黃體數和可回收的胚胎數量也會下降[32]，這可能主要是FSH濃度需要跟卵巢上卵泡發育波相對應。研究表明，每頭供體牛注射FSH的總劑量應根據供體牛品種和體重進行適當的增減[33]，比如青年供體牛體重小于經產供體牛體重，超排時應適當減少FSH劑量，而供體母牛重復超排時，隨著超排次數的增加，也應適當增加FSH總劑量。本試驗利用Folltropin-V(400 mg NIH·瓶-1)超排和牛供體，雖然不同劑量FSH可引起供體母牛一定的超數排卵效果，但是注射總劑量120 mg FSH超排青年供體牛，超排有效率只有55.56%，明顯低于其他兩個劑量。經產和牛供體FSH注射總劑量為220 mg 超排有效率也低于其他幾個劑量組，而且可用胚胎數也較少。因此，本試驗的研究結果表明，應用Folltropin-V超排優質和牛供體時，青年供體牛(16～22月齡)超排最適宜的FSH總劑量為220 mg，經產母牛(胎次=1)FSH適宜總劑量為240 mg。如果對供體母牛進行連續超排，則第一次超排后應適當增加FSH注射劑量。

3.3 不同同期發情方法對和牛超排效果的影響

超數排卵處理時供體母牛所處的發情周期階段可顯著影響供體牛超排效果[34]。許多研究表明，無論是eCG還是FSH超排供體牛，黃體期中期(發情后第8～12天)開始促性腺激素處理的超排效果顯著優于卵泡期、黃體期早期(發情后第5～7天)或者黃體期后期(發情后第14天)超排處理的效果[35]。Siqueira等[36]研究表明，從發情周期第10天開始FSH處理的超排效果，無論是供體牛卵巢直徑、黃體數以及血清孕酮濃度都顯著高于發情周期第2或第18天開始處理的超排效果。

實際生產中，為了提高超排效率，需要對一群供體母牛進行同期發情處理。本試驗采用注射前列腺素并觀察發情，或者埋植陰道栓(CIDR)處理，然后超排。試驗結果表明，自然發情、前列腺素同期和埋植CIDR處理，供體母牛的超排有效率和獲得胚胎數相似，但是自然發情組供體牛頭均可用胚胎總數顯著高于PG處理組。這可能是自然發情后第8～12天時供體母牛卵巢上對外源促性腺激素敏感的中等大小卵泡數量最多，從而使更多的腔前卵泡發育成為有腔卵泡。

3.4 超排次數對和牛超排效果的影響

本試驗第二次超排供體牛的選擇是基于第一次超排結果而選擇的超排效果良好的牛只，第二次和第一次超排間隔1個月。因此，從試驗結果可以看出，青年和牛和經產和牛超排第二次回收的胚胎總數均較第一次有所增加，這可能是因為第二次超排牛只均是經過第一次超排驗證的供體牛，對FSH的反應較好。但是，本試驗結果也發現了一個與奶牛重復超排結果不一致的點，無論是青年和牛還是經產和牛，第二次超排的頭均A級胚胎數均低于第一次超排，此外，本研究結果還表明，經產牛第二次超排回收的不可用胚胎數顯著高于第一次超排，綜上表明，雖然第二次超排回收胚胎總數增加了，但是胚胎的質量可能有所下降。

4 結 論

綜合供體牛類型、超排次數、FSH劑量等多方面因素來看，在華北地區現有的生產管理水平下，和牛超排供體宜選用經產母牛，超排處理FSH總劑量宜為240 mg，這對和牛體內胚胎高效生產和核心群的建立具有一定的參考價值。