基于HPLC-MS/MS快速篩選阿卡波糖及其類似物的菌株

賴曉紅，李 敏，周 燕，夏 兵

(中國科學院成都生物研究所，四川 成都 610041)

糖尿病是一種代謝性疾病，同腫瘤、心血管疾病成為威脅人類健康的三大疾病。我國是糖尿病上升率最快的國家，目前是糖尿病患病第二大國。糖尿病已被國家列為“新藥創制科技重大專項”的十大類疾病之一，降糖藥物的研究日益重要。α-葡萄糖苷酶抑制劑是通過可逆性地抑制小腸絨毛粘膜細胞刷狀緣的α-葡萄糖苷酶對二糖或寡糖1→4糖苷鍵的水解作用，從而達到降低餐后血糖水平的效果[1]。臨床上應用α-葡萄糖苷酶抑制劑的代表性藥物主要有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇和乙格列脂[2]，其中以阿卡波糖的應用最為廣泛[3]。

阿卡波糖是游動放線菌產生的一種具有α-葡萄糖苷競爭性抑制作用的次級代謝產物，其結構是C7N-氨基環醇類的假性四糖物質[4]。Mahmud[5]指出，具有C7N-氨基環醇結構的大多數化合物均顯示出有效的α-葡萄糖苷酶抑制作用，如阿卡波糖、脂肪族素、支鏈淀粉抑素、低聚他汀。其中，氨基環醇和4-氨基-4,6-二脫氧葡萄糖組成的二單元是其顯示活性的核心結構[6]。因此，具有相同核心結構的阿卡波糖類似物大多數也具有α-葡萄糖苷酶抑制劑的作用[7]。阿卡波糖的結構復雜，人工合成較為困難、成本較高、收率較低，主要依靠生物發酵法獲取阿卡波糖[8]。

目前，國內微生物發酵法生產阿卡波糖的發酵水平較低、成本高、規模小，如果有高效的方法篩選高產量的阿卡波糖產生菌，則會大大降低阿卡波糖的生產成本。目前報道的篩選阿卡波糖發酵液的方法主要有薄層層析法(TLC)[9]、高效液相色譜法(HPLC)[10]和基于α-葡萄糖苷酶抑制劑活性的篩選方法[11-13]，如吡喃葡萄糖苷比色(PNPG)法[14]。未見基于高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)法從阿卡波糖發酵液中篩選阿卡波糖菌株的報道。本文擬通過優化串聯質譜條件，建立HPLC-MS/MS法篩選阿卡波糖產生菌，希望為推動阿卡波糖的工業化生產提供實驗方案。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UPLC/Xevo TQ超高效液相色譜-質譜儀：美國Waters公司產品；甲醇(HPLC級)：美國Fisher Scientific公司產品；超純水：由PCWJ-10超純水機制得；WCX型陽離子型交換固相萃取柱：納譜分析技術有限公司產品；阿卡波糖對照品：成都攜進生物科技有限公司產品；阿卡波糖雜質A、阿卡波糖雜質D：實驗室自制，純度大于98%。

1.2 實驗條件

1.2.1色譜條件 Waters CORTECS UPLC C18+色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.6 μm)；流動相：水(A)和甲醇(B)；梯度洗脫條件：0～2 min(5%B)，2～12 min(5%～95%B)，12～17 min(95%B)，17～18 min(95%～5%B)，18～20 min(5%B)；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；檢測波長210 nm。

1.2.2質譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測模式，多反應監測(MRM)掃描，毛細管電壓2.5 kV，錐孔電壓30 V，離子源溫度150 ℃，錐孔氣(氮氣)流速50 L/h，脫溶劑氣流速500 L/h，脫溶劑氣溫度550 ℃。

1.3 阿卡波糖菌株的培育

分別取位于成都沙河大橋旁的河邊、菜地、番茄地中適量的土壤，共采集20 g樣品。將采集的土壤翻曬自然干燥7天，稱取1 g干燥后的土壤，加入100 mL生理鹽水中，分別在40、50、60、70、80 ℃下水浴加熱20 min[9]，不加熱的土壤樣品作為空白對照，用無菌生理鹽水將樣品稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等6個濃度，接種高氏培養基培育7天，以10%接種量接種至發酵培養基，于28 ℃恒溫振蕩培養箱，以200 r/min搖瓶培養7天，得實驗用阿卡波糖發酵液[15]。

1.4 溶液配制

1.4.1對照溶液的配制 分別精密稱取適量的阿卡波糖、阿卡波糖雜質A、阿卡波糖雜質D對照品，加入甲醇超聲溶解后，再加入20 μL 0.1 g/L NaCl水溶液，于12 000 r/min離心7 min，取上層液體，即得對照品溶液。

1.4.2供試品溶液的配制 分別使用乙腈、超純水淋洗陽離子型固相萃取小柱，加入1～2 mL發酵液原樣，過濾得濾液，將處理過的發酵液稀釋約30倍(即取30 μL發酵液加超純水稀釋至1 mL)，于12 000 r/min離心7 min，取上層清液，過0.22 μm微孔濾膜，備用。

2 結果與討論

2.1 阿卡波糖及其類似物的質譜裂解

2.1.1正負離子模式的選擇 本實驗進行了阿卡波糖、阿卡波糖雜質A、阿卡波糖雜質D的質譜分析，結果表明，阿卡波糖在正離子模式下產生的碎片離子及其強度優于負離子模式，故采用正離子模式。

2.1.2特征離子碎片 阿卡波糖及其類似物的母離子[M+H]+在一定的碰撞能量下均會產生m/z304.1特征碎片。阿卡波糖及其雜質A、D的二級質譜圖示于圖1。

2.1.3質譜裂解規律 正離子模式下，阿卡波糖對照品的準分子離子峰為m/z646.3，給予其30 eV的能量碰撞誘導解離，主要裂解途徑為優先失去1個麥芽糖產生碎片離子m/z304.1，進一步碎裂再失去1個不飽和環醇，產生碎片離子m/z146.1。阿卡波糖雜質A比阿卡波糖更容易丟失1分子H2O生成碎片離子m/z628.2，阿卡波糖丟失末端1個糖單元，產生碎片離子m/z466.2，若碎片離子m/z304.1進一步丟失1分子H2O，則產生碎片離子m/z286.1。阿卡波糖雜質A和雜質D具有與阿卡波糖相同的C7N單元和相似的裂解途徑，示于圖2。

2.2 阿卡波糖及其類似物的篩選方法

超高效液相色譜以甲醇和水為流動相，樣品經梯度洗脫后進入質譜分析。以阿卡波糖及其類似物的對照品二級質譜圖為依據，在正離子模式下掃描分析物。阿卡波糖類似物具有相同的C7N單元，有報道[5]證明，具有相同的C7N單元都能產生m/z304.1子離子碎片。因此，可以利用這一質譜特征對阿卡波糖及其類似物進行篩查。

由于未進行針對性的發酵條件優化，發酵液中阿卡波糖及其類似物的濃度較低，代謝產物復雜，為了提高檢測靈敏度，采用靈敏度較高的MRM掃描模式。以阿卡波糖及其類似物的準分子離子為母離子，以其共有的m/z304.1為子離子，在MRM模式下對阿卡波糖及其類似物進行掃描，觀察是否檢測到對應化合物的峰，以此判斷發酵液中是否存在相應化合物。阿卡波糖及其類似物的母離子及特征碎片離子列于表1。阿卡波糖對照品的UPLC-MS總離子流圖示于圖3，保留時間為4.5 min。

2.3 阿卡波糖菌株的篩選

以m/z646.3為母離子，m/z304.1為子離子的MRM掃描模式分析阿卡波糖發酵液，通過對比保留時間鑒定發酵液中是否含有阿卡波糖及其類似物。本實驗篩選了來自于河邊、菜地和番茄地土壤的20種發酵液。在編號為AB/F-01樣品中，MRM掃描模式下總離子流圖的相應保留時間處有疑似阿卡波糖或阿卡波糖雜質A的譜峰(化合物1)。在阿卡波糖雜質的篩選中，編號為HE2-1C的發酵液中篩選到疑似阿卡波糖雜質D的譜峰(化合物2)，保留時間為1.8 min，強度較小。AB/F-01和HE2-1C發酵液的總離子流圖示于圖4。

圖1 阿卡波糖(a)、阿卡波糖雜質A(b)、阿卡波糖雜質D(c)的二級質譜圖Fig.1 MS/MS spectra of acarbose (a), acarbose impurity A (b) and acarbose impurity D (c)

圖2 正離子模式下，阿卡波糖、阿卡波糖雜質A和雜質D的裂解途徑Fig.2 Fragmentation pathways of acarbose, acarbose impurity A, acarbose impurity D at positive ion mode

表1 阿卡波糖及其類似物的母離子及特征碎片離子Table 1 Parent ions and characteristic product ions of acarbose and its analogs

圖3 MRM掃描模式下，阿卡波糖對照品的總離子流圖Fig.3 TIC of acarbose by MRM scanning at positive ion mode

2.4 阿卡波糖產生菌的確認

阿卡波糖對照品和阿卡波糖雜質A互為同分異構體，普通C18反相色譜柱在該條件下無法實現兩者的分離，故本實驗進行了串聯質譜分析，以確證目標化合物1。在正離子模式下，其他質譜參數與1.2.2節保持一致，分別對阿卡波糖對照品和樣品進行子離子掃描，以碰撞能量為橫坐標，碎片離子相對豐度為縱坐標，繪制能量-豐度曲線圖。結果表明，以[M+H]+為母離子進行二級質譜分析，兩者的能量曲線極為相似(見附圖S55～S56，請登錄《質譜學報》網站http:∥www.jcmss.com.cn下載)，故選取[M+Na]+作為母離子。在38、40、42、44、46、48、50 eV 7個梯度的碰撞能量下，檢測阿卡波糖和阿卡波糖雜質A的特征碎片離子m/z608.2、347.1、305.1、254.1的豐度，其能量-豐度曲線示于圖5。阿卡波糖與阿卡波糖雜質A在結構上的主要區別是胺基環醇末端糖單元的羥基和氧原子的位置，兩者在以[M+Na]+為母離子時，碎片離子存在較大差異。阿卡波糖對照品產生較大豐度的m/z608.2和m/z305.1，并且在44 eV時，m/z608.2相對豐度開始減??；阿卡波糖雜質A對照品m/z608.2和m/z305.1的整體豐度較低，變化趨勢較小，同時能產生特有的碎片離子m/z347.1，并且變化趨勢較大。

將發酵液樣品濃縮后，以[M+Na]+為母離子進行二級質譜分析，選取m/z608.2、347.1、305.1、254.1繪制能量-豐度曲線，示于圖6。通過與阿卡波糖及阿卡波糖雜質A對照品的能量曲線對比，發現其與阿卡波糖的能量曲線極為相似，因此判斷樣品中化合物1為阿卡波糖。樣品中化合物2的含量較低，不足以進行串聯質譜分析，不能確定其是否一定是阿卡波糖雜質D，有待培育出具有更高產率的阿卡波糖菌株進行驗證。

圖4 MRM掃描模式下，AB/F-01(a)和HE2-1C(b)發酵液的總離子流圖Fig.4 TIC of fermentation broth of AB/F-01 (a) and HE2-1C (b) by MRM scanning at positive ion mode

圖5 阿卡波糖(a)和阿卡波糖雜質A(b)的能量-豐度曲線圖Fig.5 Energy-abundance curves of acarbose (a) and acarbose impurity A (b)

圖6 AB/F-01發酵液中化合物1的能量-豐度曲線圖Fig.6 Energy-abundance curves of compound 1 of AB/F-01

3 結論

本研究建立了HPLC-MS/MS法篩選不同來源阿卡波糖產生菌的發酵液，根據阿卡波糖及其類似物的特征質譜峰，結合其特有的二級離子碎片峰，歸納總結質譜裂解規律。實驗表明，子離子掃描能夠確定化合物的裂解途徑，提供化合物的能量曲線，超高效液相色譜-串聯質譜系統的MRM掃描模式能定性鑒別化合物，兩者的結合使用能夠快速、高效、便捷地篩選不同來源發酵液中的阿卡波糖，并可以應用于阿卡波糖類似物的篩選。通過子離子峰可判斷子離子碎片中是否含有氮原子，進而可粗略判斷該子離子和相應化合物中是否有C7N單元。本研究為α-葡萄糖苷抑制劑新化合物的發現提供了實驗思路，有利于α-葡萄糖苷抑制類降糖藥的開發。