氣相色譜-質譜聯用法測定荷葉表面蠟質成分

羅 倩，瞿國潤，呂霽烊，孫 偉，張 薇，祝新德，石建新

(上海交通大學生命科學與技術學院，上海 200240)

原生種荷花(Nelumbonucifera)在中國有著悠久的栽培歷史。荷花是蓮科(Nelumbonaceae)蓮屬(Nelumbo)多年生水生宿根草本植物，不僅有獨特的觀賞功能，還具有藥用和食用價值。

荷葉正面擁有阻水功能和表面自清潔功能，稱為荷葉效應[1-2]。該功能源于荷葉表面的特殊結構、蠟質成分及其分布。荷葉的氣孔位于葉片的正面，其周邊表面是由微米到納米級的乳突狀小丘鋪成，上面覆蓋有管狀的蠟質成分。這些管狀結構是直鏈二醇(diols)和直鏈次級醇(secondary alcohol)因其結構特點發生彎折圍攏而成的[2-4]。該密集結構造就了荷葉獨特的阻水功能，形成了荷葉效應。

蠟質是覆蓋在植物表面最外層的一層脂類保護物質，主要由長鏈脂肪酸、烷烴、醛、酮、長鏈脂肪醇(伯醇)、次級醇、長鏈雙醇等成分組成。植物葉片表面蠟質的組成及含量因植物種類而異，而不同的蠟質組合構成了植物葉片豐富多樣的表面形態和性質，荷葉效應就是其中的典型代表。一直以來，荷葉效應的研究是材料、紡織、防腐甚至軍事等領域的關注點。有研究者提取荷葉表面蠟質成分進行自組裝，開發新型疏水材料[5]；還有學者模仿荷葉表面張力特性進行仿生材料研究[6-7]。因此，更好地了解荷葉蠟質化學成分組成能夠為這些研究提供理論依據和基礎數據。國外對荷葉效應的早期研究涉及到荷葉表面的細胞結構及覆蓋其上的蠟質類型和分布[3-4]。這些研究對荷葉表面蠟質化學成分進行了描述，但是均未對其檢測方法，尤其是鑒定方法進行說明，且對同系物和同分異構體的分析不夠深入。

本實驗擬采用氣相色譜-質譜法檢測荷葉表面蠟質成分，結合成分鑒定手段對蠟質成分中的同系物和同分異構體及其相對百分含量進行測定和比較，以期為荷葉生長發育相關機理研究和荷葉效應的應用研究提供方法支持。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

TSQ8000氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)，GC-OrbitrapTM高分辨氣相色譜-質譜聯用儀(GC-HRMS)：美國Thermo Fisher公司產品。

正構烷烴標準品混合液(C7～C40)，內標物正二十四烷烴(C24ALK)，衍生化試劑BSTFA(bis-N,N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide)，吡啶(Pyridine)：美國Sigma公司產品；氯仿(色譜純)：美國Tedia公司產品。

實驗使用的器皿和移液器等均為玻璃制品，使用前需用氯仿沖洗。

1.2 標準品制備

準確稱取一定量的C24ALK標準品于容量瓶中，用氯仿溶解并配制成濃度為0.2 g/L的標準品母液，密封后置于4 ℃冰箱保存。

1.3 實際樣品處理

新鮮成熟荷葉采摘自上海交通大學捭闔塘中，每次摘取3片荷葉。剪取每片荷葉的中間部分(2 cm×2 cm)，每個葉片取5個樣品，分別置于5個玻璃瓶內用于分析。加入2 mL氯仿、50 μL內標，提取1 min，再重復提取1次，收集2次的提取液至玻璃反應瓶中，使用氮吹儀將其吹干至100 μL，加入20 μL吡啶、20 μL BSTFA，密封后于70 ℃衍生40 min。反應結束后，將降至常溫的反應液轉移至GC樣品瓶，準備上樣。

1.4 儀器條件

儀器的實驗條件參考文獻[8]，具體條件為：DB-5ms毛細管氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；脈沖不分流進樣，壓力275.8 kPa，保持0.7 min；Agilent分流襯管；進樣體積1 μL；進樣口溫度300 ℃；爐溫箱起始溫度50 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升溫至200 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升溫至300 ℃，保持15 min；傳輸線溫度300 ℃；離子源溫度300 ℃；EI電離能70 eV；全掃描模式，質量掃描范圍m/z50～650。

1.5 高分辨氣相色譜-質譜參數

采用與1.4節相同的氣相色譜采集條件和離子源條件，分辨率60 000 FWHM；質量掃描范圍m/z50～650。

2 結果與討論

2.1 蠟質成分的鑒定

荷葉蠟質成分的總離子流圖示于圖1。其主要成分是直鏈伯醇(primary alcohol, 1-ol)、直鏈次級醇(secondary alcohol, sec-ol)和直鏈二醇(alkanediol, diol)，此外，還有直鏈脂肪酸(fatty acid, FA)、直鏈烷烴(alkane, ALK)等，詳情列于表1。該檢測結果與文獻[3-4]報道的荷葉蠟質組分基本一致。

蠟質成分的鑒定包括可能的結構組成、碳鏈長度和羥基功能團位置等?；贕C-MS聯用檢測到的離子峰和特征離子碎片，以及二醇和次級醇的質譜碎裂規律，結合相關文獻[9-11]，鑒定得到GC-HRMS對碎片精確質量數的驗證(結構精確質量偏差在1 ppm以內)，結果示于圖2。

2.1.1直鏈伯醇同系物系列 硅烷化后的長碳鏈伯醇同系物共同的特征是含有m/z57、71、73、85、103和M-15系列碎片(M是指硅烷化后的產物分子質量，15為失去CH3)。其中m/z73是硅烷化特征碎片，m/z103碎片豐度較顯著，示于圖2a。

圖1 荷葉表面蠟質成分的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of wax components on lotus leaf surface

表1 荷葉表面蠟質伯/次級醇類和二醇成分及其特征碎片Table 1 Related fragments of primary/secondary alcohol and alkane diol detected on lotus leaf surface

續表1

注：a.伯醇硅烷化產物；b.次級醇硅烷化產物；c.二醇硅烷化產物；特征碎片標注精確質量偏差圖2 荷葉蠟質成分的質譜圖及其特征碎片示意圖Fig.2 Mass spectra and fragmentation diagram of wax components of lotus leaf

2.1.2直鏈次級醇同系物及同分異構體 硅烷化后的長碳鏈次級醇同系物產物共同的特征是含有m/z57、71、73、85和M-15系列碎片，羥基在EI源轟擊碎裂會得到2個特征碎片。例如，C29-10-OL(nonacosan-10-ol)是荷葉典型的次級醇，含有一對m/z229([C10H20OTMSi]+)和m/z369 ([C20H40OTMSi]+)特征離子，以及m/z481(M-15)。根據這對特征碎片以及M-15特征離子可以鑒定不同碳鏈長度及羥基位點的次級醇(圖2b)，以及碳鏈長度相同但羥基位點不同的同分異構體(表1)。

2.1.3直鏈二醇(diol)同系物及同分異構體 硅烷化后的長碳鏈二醇同系物產物均含有m/z57、71、85系列特征離子，m/z73、147特征硅烷基化碎片及M-15和M-90(M-TMSiOH)特征碎片。不同位點的羥基會在EI源轟擊后形成多個系列的特征碎片。例如C29-4,10-diol(nonacosane-4,10-diol)形成含有1個硅烷基團的m/z145 ([C4H8OTMSi]+)、m/z369 ([C20H40OTMSi]+)，以及含有2個硅烷基團的m/z317([C10H19(OTMSi)2]+)、m/z541([C26H51(OTMSi)2]+)，這2個硅烷基團也會丟失TMSiOH，形成m/z227、451特征碎片。此外，還可觀察到m/z569(M-15)和m/z494(M-90)碎片(圖2c)。

這些直鏈二醇同系物因為2個羥基位點不同，構成的同分異構體可根據質譜特征碎片進行鑒定，結果列于表1。

2.1.4直鏈脂肪酸和直鏈烷烴 直鏈脂肪酸和直鏈烷烴通過NIST譜庫進行鑒定。

2.1.5保留指數 將C7～C40正構烷烴標準品混合液按照1.4節條件上樣，獲得烷烴保留時間[12]，然后根據線性保留指數計算公式，計算出荷葉各個組分的保留指數(RI)。

RI=100Z+100[tR(x)-tR(Z)]/

[tR(Z+1)-tR(Z)]

(1)

式中，tR為保留時間(min)；x為待分析的化合物；Z，Z+1為兩個相鄰正構烷烴的碳原子數，且tR(Z)

2.2 蠟質成分的定量分析

2.2.1各組分的含量及占比 以C24ALK為內標，計算每個成分的相對百分含量和同系物系列化合物的比例。根據GC-MS提取的特征離子響應比例，計算同系物內各個同分異構體的比例。

2.2.2荷葉中長碳鏈次級醇成分 鑒定出的長碳鏈次級醇的碳鏈長度在29～37之間，都是奇數次級醇。這組同系物以C29ol為主，相對百分含量約占86.6%，其他各成分含量列于表2，這些次級醇的羥基位點基本以第10位為主。值得一提的是，C31、C33和C35這3種次級醇均為不同羥基位點的混合物，利用GC-MS法提取特征離子進行比較分析，發現C33的次級醇應該是羥基分別在11、10和9位(按流出順序)的混合物，以C33-10-ol為主，三者百分比分別約為(11.1±1.5)%、(67.3±7.0)%和(21.6±6.0)%；碳鏈長度為35的次級醇應該是羥基分別在11、10和9位(按流出順序)的混合物，以C35-10-ol為主，三者百分比分別約為(14.6±2.3)%、(66.8±4.8)%和(18.6±5.2)%；比較特殊的是碳鏈長度為31的次級醇，其羥基位點分別在第12、11和10位(按流出順序)的混合物，以C31-12-ol為主，三者百分比分別約為(73.5±4.1)%、(23.9±4.0)%和(2.6±0.4)%，該結果與文獻[3]報道一致。此外，還發現了偶數碳鏈的次級醇，包括C28～C38的次級醇，與奇數次級醇相比，它們的含量很低。

表2 荷葉表面蠟質中次級醇和二醇的同系物及其同分異構體的相對百分含量Table 2 Relative composition of the homologue and isomer of secondary alcohols, alkane diols in the total wax of lotus leaf

2.2.3荷葉中長碳鏈二醇成分 已有文獻[1-2,9]報道，植物中的二醇來源于其對應碳鏈的次級醇。本實驗發現，荷葉中長碳鏈二醇成分以C29二醇為主，經分析，C29 diol由6種系列二醇同分異構體組成。按2個羥基位置區分，以C29-4,10-diol和C29-5,10-diol含量居多，百分比分別為(47.1±6.3)%和(37.5±4.6)%；C31、C33和C35二醇產物比較復雜，通過氣相色譜-質譜檢測發現三者含量低，存在共流出情況，因此難以單獨鑒定，以MIX代替。二醇產物的復雜性可能來自于其上游底物次級醇本身的混合性。

2.2.4荷葉表面蠟質成分的組成分析 各組分計算結果按類別分別合計后，得到每個類別組分在總組分中的占比，結果示于圖3。荷葉蠟質成分中，以二醇含量最高，約占總蠟質的71%；其次是次級醇，約占20%；再次是烷烴，約占7%；脂肪酸及伯醇類蠟質成分很低，小于1%。

3 結論

荷葉表面細胞的超微結構和分布的蠟質與荷葉效應直接相關。荷葉中含有多種化學組分，不同的化學成分需要使用不同的檢測方法。超高效液相色譜-串聯四極桿靜電場軌道阱質譜聯用技術和UPLC-Q TOF-MS/MS 技術可用于荷葉中荷葉堿和黃酮類等物質的鑒定[13-14]。荷葉表面的蠟質成分主要由非極性的脂類小分子化合物組成，因此，氣相色譜-質譜是比較理想的檢測方法。

圖3 荷葉表面各類蠟質成分的相對百分含量Fig.3 Relative contents of various wax compositions detected in lotus leaf surface

本課題組對植物表面蠟質成分測定中的氣相色譜-質譜條件進行了優化，并建立了植物組織蠟質的定性和定量方法[8]。本實驗使用更新的TSQ8000 GC-MS聯用儀，不僅成功地鑒定出荷葉蠟質中的全部蠟質成分，還利用質譜儀產生的有效離子碎片，對直鏈次級醇和直鏈二醇的不同碳鏈的同系物和相同碳鏈的同分異構體進行分析。在此基礎上，利用高分辨質譜對特征碎片的準確性進行驗證。

本方法對于進一步了解荷葉蠟質成分對荷葉乃至整個荷花植株的生長發育，以及對水淹、UV照射等自然逆境反應都具有極其重要的意義，對于深入了解荷葉效應背后的分子遺傳機制及可能的應用具有重要價值。