Ⅰ型膠原蛋白生物膜在損傷肌腱內源性愈合過程中的作用

胡興峰，李青松，季 亮，張博偉

(貴陽市第四人民醫院骨三科，貴州 貴陽 550002)

肌腱是連接肌肉與骨，并傳遞由肌肉產生的力從而帶動骨與關節活動的單軸致密纖維結締組織[1]，在機體關節運動中起著極為重要的作用。肌腱損傷后往往導致患肢功能障礙甚至勞動力喪失，對患者生活質量產生嚴重影響。

近年來，關于如何促進損傷肌腱的再修復、提高肌腱愈合質量并最終恢復患者肢體功能的分子生物學水平研究較多[2]。Wu等[3]發現，通過基因轉染方法可以有效提高肌腱愈合程度；Mao等[4]將血管內皮生長因子轉染腺病毒載體后植入損傷肌腱，證實轉染的基因可以提高肌腱自然愈合的能力，加速肌腱細胞增殖，促進肌腱愈合；還有學者發現，干細胞移植后可以被誘導向肌腱細胞分化，高表達肌腱標志物及Ⅰ型膠原蛋白，顯著提高肌腱愈合質量[5-6]。以上研究均能促進肌腱愈合，但是都未能解決損傷肌腱術后粘連導致功能障礙的問題。因此，有研究嘗試在損傷肌腱周圍建立可降解的生物屏障以降低粘連發生率，取得較好效果[7]。目前報道的可用于防粘連的生物材料有五十余種[8]，且這些生物材料大多可被完全吸收，其作用機制是通過干擾肌腱外源性愈合，從而為損傷肌腱提供良好的生物屏障，達到預防粘連的效果[9]。然而可吸收醫用防粘連材料在預防肌腱粘連的同時，是否在損傷肌腱內源性愈合過程也有促進作用，目前尚未見相關報道。本研究選擇Ⅰ型膠原蛋白生物膜(以下簡稱生物膜)進行相關動物實驗，探討生物膜在肌腱內源性愈合過程中的作用，以期為其臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 16只健康SPF級雄性SD大鼠，6～8周齡，體質量220 g左右，購于重慶恩斯維爾生物科技有限公司。大鼠自由飲水、進食，于溫度23～25 ℃動物房12 h/12 h晝夜交替適應性飼養1周后進行實驗。實驗過程中對動物的處理嚴格遵循《實驗動物管理條例》(2017年)。本研究經貴陽市第四人民醫院倫理委員會批準。

1.1.2 主要儀器與試劑 電熱恒溫鼓風干燥箱(博訊，上海)，超凈工作臺(VS-1300，蘇州)，Ⅰ型膠原蛋白生物膜(無錫貝迪生物，江蘇)，倒置顯微鏡、照相系統(OLYMPUS，日本)，激光共聚焦熒光顯微鏡、切片機、展片機、烤片機(Leica，德國)，多聚甲醛(生工，上海)，蘇木素染液(南京建成，江蘇)，伊紅染液(碧云天，上海)，中性樹脂(國藥集團，上海)。一抗：兔來源Anti Collagen I(博奧森，北京)，二抗：山羊抗兔Anti CY3(abcam，英國)。免疫熒光一抗稀釋液(碧云天，上海)，免疫熒光二抗稀釋液(碧云天，上海)，山羊血清(Hyclone，美國)，DAPI染色液(碧云天，上海)，抗熒光淬滅劑(碧云天，上海)。

1.2 大鼠損傷肌腱模型建立及分組

將16只大鼠分成實驗組和對照組，每組8只。大鼠稱重，7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉生效后常規備皮，75%酒精棉球消毒；沿跟腱位置縱向切開顯露肌腱，切除腱鞘約1 cm，在腱性移行部至跟腱止點的中點處銳性橫斷。對照組在跟腱離斷后，采用改良Kessler法縫合，用無菌PBS沖洗2～3次；實驗組在跟腱離斷，改良Kessler法縫合后，剪下2 cm×1 cm的生物膜包裹住跟腱縫合部位并使其與腱組織緊密貼合。2組大鼠術后局部注射青霉素抗感染，關閉手術切口，予以石膏外固定，隔日換藥1次。

1.3 取材

分別于治療后第1、2、3、4周取材，每組每次取2只大鼠，共4個樣本。解剖顯露手術區域，行大體觀察，包括傷口皮膚顏色、溫度、滲出及深部組織愈合情況等。進一步解剖損傷處跟腱組織，觀察跟腱損傷處愈合及生物膜吸收情況。取損傷處肌腱組織，無菌PBS清洗后用4%多聚甲醛固定，于4 ℃保存，用于后續實驗檢測。

1.4 HE染色觀察

將組織分別浸泡在75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ和100%乙醇Ⅱ中10 min進行脫水。將脫水后的組織分別浸泡在1,2-二甲苯、1,3-二甲苯、1,4-二甲苯中10 min進行透明。將透明處理的組織浸泡于融化的石蠟中3 h，進行包埋。用切片機將石蠟塊中的組織切成5 μm薄片，并將其緊貼平鋪于防脫玻片上，置于55 ℃烤片機上。將石蠟切片分別浸泡于1,2-二甲苯、1,3-二甲苯、1,4-二甲苯中10 min脫蠟，隨后浸泡于100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、85%乙醇、75%乙醇中5 min。雙蒸水清洗3次，每次2 min。切片蘇木素染色10 min，自來水沖洗多余染色液約5 min，蒸餾水再洗滌1遍(數秒即可)。若蘇木素著色過深則可用1%鹽酸酒精脫去細胞質中多余的蘇木素染色液。伊紅染色30 s，自來水沖洗多余染液約3 min，蒸餾水再洗滌1遍。中性樹脂封片。用光學顯微鏡觀察炎性細胞、成纖維細胞和膠原纖維的分化情況，并進行分析。

1.5 免疫熒光檢測Ⅰ型膠原蛋白表達

切片、脫蠟、復水同HE染色，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中，于微波爐內加熱，使容器內液體溫度保持在92～98 ℃，保持10～15 min。取出容器，室溫冷卻10～20 min。PBS清洗，蒸餾水清洗，PBS浸泡5 min。在切片組織上滴加山羊血清，室溫封閉60 min；吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張切片組織滴加足夠量的一抗Collagen I(1∶100)并放入濕盒，于4 ℃孵育過夜；取出濕盒，室溫復溫30 min，PBS浸洗3次，每次3 min，吸水紙吸干切片上多余液體后滴加熒光二抗CY3(1∶800)，濕盒中于37 ℃孵育60 min(注：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都在暗處進行)。PBS浸洗3次，每次3 min。滴加DAPI避光孵育15 min，對標本進行染核，PBS浸洗4次，每次5 min以洗去多余的DAPI；用吸水紙吸干切片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。每6孔板中隨機選擇2孔，每孔5個視野進行拍照，并用Image J軟件進行圖像分析，計算細胞數。每個高倍視野下計算能夠表達Ⅰ型膠原蛋白特性的細胞比例，并進行統計學分析。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 損傷肌腱標本大體觀察

治療后1周，實驗組手術切口利用血管鉗鈍性分離顯露深層組織，皮膚和周圍組織可見水腫，肌腱修復區域愈合不牢，輕輕牽拉即可見組織分離，生物膜清晰可辨，并且較易與肌腱組織分開；對照組亦可見周圍組織水腫，肌腱斷端接觸良好。治療后2周，實驗組手術切口愈合良好，需銳性切開顯露，手術區域組織水腫表現不明顯，生物膜與肌腱組織及肌腱斷端聯系緊密；對照組可見損傷肌腱處與周圍組織輕微粘連，但輕微鈍性分離即可分開。治療后3周，實驗組手術切口愈合，生物膜與肌腱組織聯系致密，不能將其完整分開，并且生物膜出現液化降解現象，肌腱損傷處與周圍組織界限清楚，肌腱活動較好；對照組損傷肌腱處可見與周圍組織形成粘連帶。治療后4周，實驗組見生物膜被降解吸收，損傷肌腱組織與周圍組織有明顯界限，肌腱活動不受限制；對照組肌腱損傷處與周圍組織粘連帶更加明顯，肌腱活動較差。

2.2 損傷肌腱修復后組織學觀察

治療后1周，2組損傷肌腱組織周圍出現大量淋巴細胞和少量嗜中性粒細胞，未見巨噬細胞，少量成纖維細胞聚集。隨著時間延長，到第3～4周時，實驗組術區生物膜外大量成纖維細胞聚集和瘢痕組織形成，膜內肌腱細胞膠原纖維沉積呈線性排列，方向一致，較為整齊，并見肌腱細胞長入生物膜內(圖1)；而對照組損傷肌腱組織周圍可見大量成纖維細胞及毛細血管向正常肌腱細胞浸潤，與肌腱細胞融合，可見極少量嗜酸性粒細胞，膠原纖維排列紊亂，肌腱外源性愈合優勢明顯(圖2)。

a：治療后1周；b：治療后2周；c：治療后3周；d：治療后4周

a：治療后1周；b：治療后2周；c：治療后3周；d：治療后4周

2.3 免疫熒光檢測Ⅰ型膠原蛋白表達

免疫熒光結果顯示，2組成熟新生肌腱細胞多表達Ⅰ型膠原，核被染成藍色熒光，顯微鏡下觀察可見熒光足夠亮，并能實現照片曝光；隨著治療時間延長，2組Ⅰ型膠原蛋白的表達均增加，熒光能夠穩定較長時間，且實驗組Ⅰ型膠原蛋白表達高于對照組(P<0.05)，膠原纖維排列更加有序(圖3、4)。

a：治療后1周；b：治療后2周；c：治療后3周；d：治療后4周

a：治療后1周；b：治療后2周；c：治療后3周；d：治療后4周

2.4 Ⅰ型膠原蛋白特性的細胞比例

治療后2組表達Ⅰ型膠原蛋白特性的細胞比例比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 Ⅰ型膠原蛋白特性的細胞比例

3 討論

肌腱損傷在創傷外科較為常見，損傷后肌腱愈合的質量直接影響到患者的肢體功能，肌腱愈合是由內源性和外源性共同作用的一個復雜過程[10]。其中，內源性愈合主要依靠肌腱細胞的增殖來完成修復，其修復過程屬于同源性修復[11]；而外源性愈合則是通過周圍組織的成纖維細胞和毛細血管增生完成修復，其修復過程屬于非同源性修復，這也是外源性愈合最終導致肌腱粘連的原因[12]。

國內外學者嘗試應用各種生物或者非生物材料作為損傷肌腱修復的物理屏障，預防肌腱術后粘連，這些材料大致可分為兩大類，即以羊膜、膠原蛋白、殼聚糖為代表的天然生物材料類和以聚合物為代表的人工合成類。白江博等[13]發現新鮮羊膜對于早期肌腱修復更具有優勢；然而Lepp?nen等[14]的研究發現，利用同種異體羊膜移植并不能有效提高肌腱的一期愈合效果，但也指出這可能與技術因素有關。另有研究發現，通過靜電紡絲技術制備的電紡聚乳酸—羥基乙酸共聚物/Ⅰ型膠原—聚己內酯雙層膜具有組織相容性好、無毒等優點，可通過電紡聚乳酸—羥基乙酸共聚物抑制成纖維細胞生長、Ⅰ型膠原—聚己內酯促進肌腱細胞黏附存活，有效預防肌腱斷裂后腱周粘連的發生[15]；另有研究報道這種多層電紡生物膜不但在預防肌腱粘連方面有優勢，而且具有抗炎作用[16-17]。Yousefi等[18]利用納米技術制備了一種新型納米氧化鋅(ZnO)納米殼聚糖材料用于促進損傷肌腱修復，8周后材料被完全吸收，肌腱周圍無炎癥反應現象，粘連少。這些新型材料在肌腱愈合預防粘連方面均有良好的效果。本研究選用的生物膜是由2～3周歲黃牛跟腱經化學提取合成的高純度的具有三維空間結構的Ⅰ型膠原，結果表明，實驗組損傷肌腱與周圍組織界限清楚，極少粘連，肌腱愈合質量明顯高于對照組。說明使用Ⅰ型膠原蛋白生物膜能夠有效阻止損傷肌腱的外源性愈合過程，并且生物膜能夠充分被吸收，生物相容性好，可有效預防其術后粘連的發生。

膠原蛋白具有低免疫原性、高生物相容性和高組織降解性等特點[19]，是目前的研究熱點。查朱青等[20]的研究發現，Ⅰ型牛膠原蛋白生物膜不僅可以有效減少粘連，還可以增強損傷肌腱愈合的生物力學特性；單海民等[21]的研究發現，Ⅰ型牛膠原蛋白生物膜安全有效，且在預防肌腱術后粘連方面有優勢。近年來，膠原蛋白更是被作為一種天然的生物資源而廣泛應用于醫學領域生物材料的制作[22]。Müller等[23]認為Ⅰ型膠原蛋白海綿可促進損傷肌腱愈合，但未闡明具體機制；Rieu等[24]認為在組織工程方面，膠原蛋白支架在損傷肌腱修復及預防術后粘連上具有廣闊的應用前景。肌腱損傷的愈合過程是多因素共同作用的結果，隨著研究的深入，不僅有新的治療方法報道，研究者們也從以往的單純阻止肌腱外源性愈合過程到現在如何同時促進損傷肌腱內源性愈合過程方向發展，更加關注于肌腱愈合的質量和肢體的功能恢復[25]。本研究選擇Ⅰ型膠原蛋白生物膜進行相關動物實驗，初步驗證了生物膜對損傷肌腱內源性愈合起到了促進作用。免疫熒光檢測能夠對肌腱內源性愈合過程中起主要作用的Ⅰ型膠原蛋白進行標記追蹤，直觀反映出生物膜在損傷肌腱內源性愈合過程中起到的作用。本研究免疫熒光結果表明，2組Ⅰ型膠原蛋白的表達均增加，熒光能夠穩定較長時間，且實驗組Ⅰ型膠原蛋白表達高于對照組，膠原纖維排列更加有序，這為以后對生物膜促進損傷肌腱內源性愈合過程的具體作用機制的研究提供新的方向。

綜上所述，Ⅰ型膠原蛋白生物膜材料在損傷肌腱內源性愈合過程中有明顯促進作用。