皰疹病毒ICP22蛋白研究進展

李陽光，吳 英，汪銘書，程安春*

(1.四川農業大學 動物醫學院禽病防治研究中心，成都 611130； 2.四川農業大學 預防獸醫研究所，成都 611130； 3.四川農業大學 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130)

皰疹病毒科病毒是一類雙鏈DNA病毒，其典型結構包括120～245 kb長的雙鏈DNA基因組、20面體核衣殼(caspid)、皮層(tegument)和囊膜(envelope)[1]。根據第10次ICTV報告，皰疹病毒家族分為α、β和γ 3個亞科[2]，α皰疹病毒主要包括單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus 1, HSV-1)[3]、水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus, VZV)[4]、牛皰疹病毒(bovine herpesvirus 1, BHV)[5]、馬立克病毒(Marek’s disease virus, MDV)[6]、馬皰疹病毒1型 (equine herpesvirus 1, EHV-1)[7]、偽狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)[8]、鴨腸炎病毒(duck enteritis virus, DEV)[9-12]等。典型β、γ類皰疹病毒分別是人巨細胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)和愛潑斯坦-巴爾病毒(epstein-barr virus, EBV)。眾多研究表明皰疹病毒ICP22蛋白及其同源物對潛伏感染的建立、病毒復制、細胞凋亡、成熟病毒粒子出芽等多方面至關重要，現對其研究進展做簡要概述，以期為ICP22及同源物基本特性以及參與病毒生命周期的深入研究提供參考。

1 皰疹病毒US1基因及其同源基因特點

皰疹病毒基因組一般由長獨特區(unique long, UL)、短獨特區(unique short, US)、末端重復序列(terminal repeat sequence, TRS)以及內部重復序列(internal repeat sequence, IRS)組成，構成UL-IRS-US-TRS形式[13]。當病毒粒子進入感染細胞后，開始啟動病毒基因的串聯表達與蛋白翻譯表達，根據轉錄順序可分成立即早期(IE)、早期(E)和晚期(L)3類[14-15]。IE基因轉錄不需要依賴于新合成的DNA或蛋白質，其編碼蛋白在病毒感染過程中起廣泛的調控作用，E基因表達需要IE基因激活，通常編碼病毒基因復制相關蛋白，L基因主要編碼囊膜糖蛋白，其表達依賴于病毒DNA的復制[16]。皰疹病毒US1基因及其同源物序列或結構有所差異，如HSV-1僅含1個1 260 bp的US1基因，類屬立即早期基因[17]，HCMVUS1屬于早期基因[18]，MDVUS1基因最初被定義為IE基因，隨后被證明是L基因，感染后期才能被檢測到[6]。大多數皰疹病毒US1基因以對稱雙拷貝形式位于內部重復區和末端重復區，且轉錄方向相反。如VZV ORF63/70為834 bp的立即早期基因[19]，其編碼蛋白常稱之為IE63。1 050 bp長的PRVRsp40基因類型較為特殊，文獻報道該基因非典型性動力學表達，不屬于IE基因[20]。BHV-1 US區域沒有US1基因，但是由112 768—113 670 bp和124 548—125 450 bp[21]轉錄產生、同時具有IE與L動力學的1.7 kb轉錄本編碼蛋白定義為立即早期蛋白BICP22[5]。EHV-1中US1同源基因是長為1 410 bp的IR4基因，其差異表達1.4 kb的早期和1.7 kb的晚期轉錄本，編碼的早期蛋白EICP22蛋白相對分子質量介于42～47 ku[22]。最新報道表明DEVUS1基因為990 bp的反向重復的IE基因[23-25]。此外，HSV-1中存在一個US1 N端1—146 AA截短表達的基因——US1.5，在感染晚期才會被檢測到，UL13蛋白激酶對US1.5蛋白進行翻譯后修飾，從而正常表達UL38和US11等晚期基因子集[17]，但是US1.5的具體功能以及與US1的關聯目前還不清楚[17]。

2 皰疹病毒ICP22蛋白的翻譯后修飾

序列比對發現已有報道的皰疹病毒ICP22蛋白含有一個涉及蛋白轉錄調控等重要功能的保守結構域IE_68(圖1)。已有報道的ICP22蛋白合成加工過程涉及多種修飾，各類修飾往往導致相對分子質量變大。例如，HSV-1 UL13與US3病毒蛋白以及未知的細胞蛋白可以磷酸化ICP22，其中，Thr-116和Thr-193位點的磷酸化與病毒毒力相關[26-27]，另外還存在經細胞酪蛋白激酶介導的核苷酸化修飾，眾多修飾導致ICP22表觀相對分子質量為68 ku[28]。VZV ORF63基因編碼的IE63蛋白可被細胞酪蛋白和ORF47激酶以及CDK 1、CDK 2磷酸化，最終呈現45 ku的表觀相對分子質量[29]。其中，CDK 1磷酸化Ser-224涉及IE63細胞定位以及轉錄調控功能，CDK 2磷酸化Thr-171、Ser-181和Ser-186從而介導IE63與ASF-1的相互作用[30]以及VZV潛伏感染的建立[31]。近期研究表明，DEV ICP22相對分子質量比預期偏大22 ku，生物信息學分析結果顯示，DEV ICP22含眾多磷酸化和糖基化位點，推測其表觀相對分子質量偏大是各類細胞激酶作用所致[24]。

保守域HERPES_IE68以灰色突出顯示，保守氨基酸以黑色顯示The conserved HERPES_IE68 domain is highlighted in grey, and the conserved motifs are shown in black圖1 皰疹病毒ICP22蛋白序列比對Fig.1 Sequence analysis of herpesvirus ICP22 amino acids

3 皰疹病毒ICP22細胞內定位

不同皰疹病毒ICP22細胞內定位不盡相同，如MDV ICP22在DEF中定位于細胞質[3]，而HSV-1 ICP22在感染細胞和轉染細胞中均定位細胞核。HSV-1 ICP22含有兩個獨立的核定位信號(nuclear localization sequence, NLS)，NLS1位于ICP22 16—31AA，NLS2位于ICP22 118—131AA[32]。然而N端缺失1—146AA的US1.5定位于核，推測ICP22還有未被鑒定出或入核能力較弱的核定位信號[33]。潛伏感染階段的IE63定位于細胞質，體外裂解性感染時則定位細胞核，突變磷酸化位點后定位由核轉變為質，表明激酶的磷酸化作用對IE63定位很重要[34]。研究表明，PRV ICP22定位于細胞核，其41—60AA為典型單分核定位信號，其49—50AA(KR)為關鍵氨基酸。同時，Cai等[8]發現PRV ICP22是通過Ran、importinα1-和α7介導途徑靶向細胞核。最新研究發現，DEV ICP22在感染或轉染情況下均定位于核，進一步發現305—314AA為一典型單分核定位信號，其中，309R為關鍵位點，然而突變該位點的重組病毒感染DEF后ICP22仍定位于核，推測感染情況下有其他病毒蛋白或ICP22本身還未鑒定出的NLS帶動其入核[24]。

4 皰疹病毒ICP22功能研究進展

4.1 ICP22影響病毒潛伏感染的建立

潛伏感染是病毒持續性感染的狀態，病毒基因存在于組織或細胞中，既不產生感染性疾病也不出現臨床癥狀，在某些條件下可被激活，急性發作而出現癥狀，此時可以檢測出病毒[35]。HSV-1 ICP22在潛伏感染階段不表達，但是缺失ICP22可顯著降低病毒復制水平以及在感染小鼠三叉神經中建立潛伏感染的能力[3]。目前，已確定HSV-1 ICP22 Thr-193、Tyr-116的磷酸化與病毒毒力相關[27]，Ser-34或Tyr-116單突變即可減弱HSV-1引起的眼疾嚴重程度。最新研究發現，ICP22與CD80啟動子直接結合可抑制眼部免疫反應，同時該抑制能力取決于再激活病毒的復制水平，因此作者推測，Ser-34或Tyr-116位點突變不影響ICP22與CD80啟動子的結合，ICP22對CD80的抑制作用可保護宿主免受病原引起的病理侵害[3]。

VZV可表達VZV-潛伏相關轉錄本(VZV latency transcript, VLT)和ORF63兩種轉錄本[4]。ORF63是VZV復制必需基因，其編碼蛋白IE63不僅作為激活E基因的轉錄調節因子，還能改變神經元對細胞凋亡的敏感性以及減弱Ⅰ型干擾素(interferon, IFNs)信號傳導的免疫反應，在潛伏期作為主要表達產物可被檢測到[36]，ORF63缺失導致VZV在人黑素瘤細胞中的復制以及嚙齒動物中潛伏期的建立受到損害[29]。此外，ORF61編碼蛋白IE61是豚鼠腸道神經元中IE63入核的必需蛋白，推測VLT通過對ORF61轉錄和翻譯的阻遏作用將IE63攔截在細胞質并阻止病毒的反式激活[37]，這可能是潛伏感染期間IE63定位于細胞質的原因之一。

MDV ICP22參與病毒潛伏感染的研究已有較多報道。潛伏期間MDV-miR-M1-5P和MDV-miR-M5-3p能下調潛伏期MDV ICP22 mRNA水平，而MDV-miR-M4-5P和細胞同源物GGA mir-155-3p可以上調ICP22表達[6，38]。Boumart等[6]提出一個假設模型，首先是GGA miR-155-3P促進ICP22表達，稍后GGA miR-155-3P以尚不清楚的分子機制被抑制表達。然后，被感染細胞中MDV-miR-M4-5P促進ICP22表達，由于MDV-miR-M4-5P在感染的各個階段都表達，因此，潛伏階段MDV-miR-M1-5P和MDV-miR-M5-3P會抑制ICP22表達從而保證潛伏感染細胞的存活[6]。

4.2 ICP22的轉錄調控作用

細胞RNA聚合酶Ⅱ (RNA polymerase Ⅱ, RNA Pol Ⅱ)大亞基的保守C端結構域(C-terminal domain, CTD)由Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7 7肽序列重復組成，在所有真核生物中均保守，能為RNA Pol Ⅱ復合物招募mRNA加工和染色質修飾所需因子從而參與基因轉錄[39]。

正向轉錄延伸因子b(positive transcription elongation factor b, P-TEFb) 是細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶9(cyclin-dependent kinases, CDK 9)和某些周期蛋白形成的復合物，可被募集到轉錄起始的啟動子區域磷酸化RNA Pol Ⅱ CTD Ser-2，進而促進轉錄延長。HSV-1感染后，ICP22與P-TEFb亞基CDK 9直接結合，阻斷其募集從而抑制基因轉錄，該過程還可能有US3的參與[40]。RNA Pol Ⅱ可與ICP22、CDK 9共定位[41]，猜測ICP22以某種未知方式調節CDK 9活性。此外，ICP22表達可使RNA Pol Ⅱ CTD Tyr-1、Ser-2磷酸化丟失[42]，推測ICP22可參與HSV-1感染細胞中RNA Pol Ⅱ的修飾進而抑制病毒與宿主基因的轉錄。針對上文所述的轉錄抑制情況，HSV-1病毒蛋白VP16能夠聯合宿主細胞因子1(host cell factor-1, HCF-1)、八聚體轉錄因子(octamer transcription factor, Oct-1)等識別IE基因啟動子上游區域的TAATGARAT特定序列元件，從而打破ICP22對IE基因轉錄的限制，有利于E和L基因的轉錄表達[40]。此外，ICP22可導致促染色質轉錄因子(facilitates chromatin transcription, FACT)在細胞核中重新定位，還可招募其與轉錄延伸因子Spt5(Supt5 h)、Spt6(Supt6 h)等至病毒基因組以促進病毒γ基因的轉錄表達[43]。綜上表明，ICP22能參與HSV-1劫持宿主細胞RNA Pol Ⅱ以高效轉錄病毒基因。然而關于病毒感染后宿主基因轉錄受抑制模型仍需更多討論，1)許多細胞系中HSV-1病毒基因轉錄以及L基因表達不絕對需要ICP22，例如在Vero細胞系中ICP22缺失株與野生株表型幾乎一致。2)無論是否發生磷酸化修飾，RNA Pol Ⅱ均可被募集到病毒的轉錄/復制區室[44]。3)常規轉錄因子TFⅡE是未感染細胞中轉錄起始所必需的，感染HSV-1后在IE蛋白作用下丟失，有可能因此而導致細胞基因的轉錄受到抑制[45]。但是ICP22缺失株并不能消除這一現象[45]，說明ICP22可能不參與這一路徑。

VZV IE63可以與病毒反式激活因子IE62、RNA Pol Ⅱ和感染細胞核中的細胞延伸因子EF-1α啟動子相互作用而參與VZV基因轉錄調控，其中，IE63可以結合與EF-1α啟動子相互作用的細胞因子，從而反式激活其表達[46]。IE63強烈抑制IE62表達，也可以與IE62結合上調gI糖蛋白啟動子的表達，還可以作為VZV和異源病毒許多啟動子的轉錄阻遏物[29]。已經明確IE63可通過1—142AA序列與IE62相互作用并在感染細胞中部分共定位，還可與RNA Pol Ⅱ復合存在于感染細胞中，但是IE63-ORF47復合物能否改變RNA Pol Ⅱ的磷酸化進而影響VZV基因調控尚不清楚[47]。此外，干擾素(interferon，IFNs)在VZV致病機制中起重要作用，研究發現，IE63可通過抑制真核翻譯起始因子2(eukaryotic initiation factor 2, eIF2)的磷酸化從而抑制IFN下游信號通路，同時，IE63還可介導eIF2脫磷酸化，具體作用機制也還未知[45]。這些發現表明，VZV可能已進化出復雜機制來逃避細胞保護路徑，IE63在VZV致病過程中具有重要作用。

EHV-1病毒基因組僅表達一個IE蛋白(IE protein, IEP)，可反式激活E和一些L基因以及異源病毒基因啟動子[48]。早期蛋白EICP22是不結合DNA的非必需基因，對EHV-1基因啟動子的反式激活作用很弱，不過EICP22 142-239AA序列可介導兩者相互作用形成EICP22P-IEP復合物提高IEP與其靶序列的結合速率以促進E以及L基因的表達，但是任何形式的EICP22P都不能克服IEP對自身啟動子的抑制作用[49]。此外，純化的GST-EICP22融合蛋白能夠恢復某些IEP突變體的DNA結合能力，推測EICP22與IEP的相互作用有助于招募轉錄因子和/或促進轉錄起始的細胞因子，增強IEP和病毒基因啟動子的結合活性以提高轉錄效率。另外，研究表明EICP22 124—143AA可介導自身相互作用形成二聚體甚至高階復合物，但僅有全長EICP22能與IEP協同作用促進反式激活[50]。Derbigny等[51]證明EICP22突變體的穩定性，因此，猜測EICP22P突變體蛋白構象發生改變使得與IEP的相互作用受損，相互作用的非必需序列有助于招募特定細胞因子到蛋白復合物中。然而EICP22調節病毒基因表達的確切機制仍然不清楚，后續可探究EICP22P與細胞轉錄因子有無相互作用和EICP22P-IEP復合物反式激活過程中EICP22參與調節的作用機制。

復制機制研究較為深入的是HSV-1和VZV，結果表明兩者都已進化出篡奪細胞基因復制系統以大量產生病毒后代的機制，均編碼與RNA Pol Ⅱ相互作用的IE蛋白ICP22和IE63。已經明確ICP22蛋白及其同源物在基因調控中具有重要作用，但如何參與劫持細胞基因表達系統以促進病毒基因復制以及轉錄本的翻譯，如何在不同細胞系、不同病毒中發揮獨特作用還知之甚少，關于α皰疹病毒基因調控仍需更多探索。

4.3 ICP22調節病毒核出芽

皰疹病毒核衣殼太大不能自由穿過核膜。因此，細胞核內的子代核衣殼首先通過內核膜進入核周進行初級囊膜包膜，然后與外核膜融合進行去囊膜化從而進入細胞質[52-55]。就HSV-1 而言，由UL31和UL34構成的核出芽復合體(nuclear egress complex, NEC)對病毒核衣殼的初次包裝很關鍵[56]。ICP22可與UL31、UL34共定位于細胞核膜，缺失ICP22后UL31和UL34定位發生改變，反之UL31缺失亦可影響ICP22細胞內定位[57]。此外，ICP22缺失可導致細胞核周初級囊膜包被病毒粒子數量大量減少，核中積累大量衣殼。以上資料表明ICP22是病毒核出芽的重要非必需蛋白，可能通過與UL31和/或UL34相互作用來發揮作用[58]。

4.4 ICP22參與細胞凋亡

一些病毒能致宿主細胞凋亡[59-61]，細胞凋亡是一種必不可少的復雜天然免疫機制，可以有效清除感染或衰老細胞[62]。HSV-1感染后期ICP22可通過US1.5激活半胱天冬酶3(caspase-3)而實現促凋亡作用[52]；隨后發現ICP22 蛋白具有抗細胞凋亡的作用，進一步研究發現ICP22缺失可下調US5基因(具有抗細胞凋亡功能)表達水平，推測ICP22可通過影響US5表達進而發揮抗凋亡作用[63]，因而推斷ICP22參與細胞凋亡過程且發揮雙重作用。You等[52]、游韶平等[64]發現單獨表達HSV-2 ICP22蛋白只能較低程度地抵抗放線菌素D(act-dactinomycin D, ActD) 誘導的細胞凋亡，因而推測ICP22不是直接作用于細胞，而是通過調節病毒基因表達以及與病毒和/或細胞蛋白相互作用而發揮抗細胞凋亡作用，各類調節路徑相互作用導致HSV-1 ICP22對細胞凋亡有雙重作用。另一方面，p53可通過激活Bax或抑制Bcl-2來調節各種細胞途徑并控制細胞凋亡[65]，還可在感染后期可抑制ICP0表達，不過該抑制作用可被ICP22拮抗，從而促進細胞存活和病毒有效復制[28]。

IE63缺失病毒感染細胞的凋亡程度明顯增加，此外單獨表達IE63即可降低細胞凋亡水平，表明IE63具有抗細胞凋亡作用[66]。已經明確磷酸化eIF2可以介導細胞凋亡信號轉導[67]，而IE63能抑制eIF2的磷酸化以及介導eIF2脫磷酸化[52]，因而推測IE63抑制細胞凋亡的作用路徑可能與eIF2(脫)磷酸化有關。不過還未發現IE63有HSV-1 ICP22的促凋亡作用，表明即使同源蛋白之間也可能存在不同功能與作用機制[52]。

4.5 ICP22參與細胞自噬與抗病毒反應

自噬是一種溶酶體降解系統，可促進細胞內蛋白質和細胞器的分解，傳統上被認為是一種保護機制，然而在特定條件下也可以用作促死亡途徑[68-69]。HSV-1感染細胞中，核仁蛋白(protein interacting with carboxyl terminus 1, PICT-1)通過抑制核糖體RNA(ribosomal RNA, rRNA)轉錄和失活AKT/mTOR/p70S6K通路而觸發促死亡性自噬[70]，病毒蛋白伴侶ICP0和ICP22與PICT-1相互作用參與到上述過程，然而ICP22的具體作用機制尚不清楚[71]。

HSV-1感染后，細胞蛋白會發生劇烈的空間重組并錯誤折疊到細胞核中，形成病毒誘導分子伴侶富集域(virus-induced chaperone-enriched, VICE)，其中熱休克同源蛋白70(heat shock cognate protein 70, Hsc70)可介導抗原遞呈與細胞自噬過程，參與細胞抗病毒作用[72]。單獨表達ICP22即可形成ICP22、Hsc70和錯誤折疊蛋白質構成的核內復合物，感染ICP22缺失病毒的情況下不會誘導VICE結構域的形成，表明ICP22是誘導VICE所必需的[73]。最新研究表明，ICP22作為一種J樣蛋白，可能通過Hsc70與Hsp40/ Hsp70復合物相互作用，促使錯誤折疊蛋白向核聚集以降低細胞毒性來發揮抗病毒作用[74]。不過ICP22完整作用途徑以及為何Hsc70只能與ICP22突變體而非全長免疫共沉淀還不清楚[74]?？傊?，作為第一個病毒J樣分子伴侶蛋白以及抗病毒藥物開發的靶標[72]，ICP22在抗病毒科學研究與臨床應用中具有重大意義。

5 小 結

皰疹病毒ICP22蛋白是一個翻譯后修飾的多功能蛋白，可以參與病毒潛伏感染的建立、調控病毒基因轉錄以及成熟病毒粒子出芽，也涉及細胞凋亡、自噬和抗病毒等生命周期重要過程，但其機制大多不明確，對其開展深入研究將有利于皰疹病毒感染疾病的治療與防控。此外，有關ICP22蛋白的報道大多源于人皰疹病毒，對動物皰疹病毒、特別是以ICP22作為靶標的新藥研究，應該成為今后的研究重點之一。