禽腺病毒血清4型感染雞組織中NLRP3基因轉錄水平的實時熒光定量PCR分析

郭慧芳，李 寧，王白玉，喬麒龍，黃 慶，李永濤，王 增，趙 軍

(河南農業大學牧醫工程學院，鄭州 450046)

禽腺病毒血清4型(fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4)是屬于禽腺病毒科、禽腺病毒屬的雙鏈DNA病毒，是引起肝炎-心包積液綜合征(hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS)的主要病原[1]。HHS于1987年最早發生于巴基斯坦，隨后在印度、科威特、伊拉克、日本、韓國、墨西哥等國家以及中美洲、南美洲等地區發生。自2015年5月份以來，由FAdV-4新基因型導致的HHS在我國主要養禽地區流行，給我國養禽業造成了巨大損失[2-4]。目前，FAdV-4的致病機制尚不明了?，F有的研究顯示，致病性FAdV-4感染后誘導雞天然免疫應答，肝中白介素1β(IL-1β)的表達量顯著升高[5-6]。

IL-1β的表達和分泌與NLRP3炎癥小體密切相關。多種刺激原可以激活胞質天然免疫信號受體NLRP3，激活后的NLRP3使NLRP3炎性小體組裝活化，從而引發IL-1β的分泌[7-9]。NLRP3是宿主細胞的核苷酸結合寡聚結構域(nucleotide binding oligomerization domain, NOD)樣受體(NLRs)病原模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRS)識別病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPS)或危險相關分子模式(danger associated molecular patterns, DAMPS)后，再與凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing a C-terminal caspase recruitment domain, ASC)及 Caspase-1(cysteine requiring aspartate protease-1, Caspase-1)共同組成的多聚蛋白復合體[10-13]。NLRP3炎性小體是天然免疫系統的重要組成部分，可響應病原刺激和細胞損傷，介導Caspase-1激活和促炎細胞因子IL-1β和IL-18等炎性因子的成熟和分泌，從而引發炎癥反應[14-16]。

鑒于NLRP3炎癥小體的活化與IL-1β的表達和分泌密切相關，本研究嘗試建立檢測雞NLRP3的實時熒光定量PCR方法，對FAdV-4感染雞組織中NLRP3基因的轉錄水平進行分析，以期為解析NLRP3在FAdV-4致病機制中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

致病性禽腺病毒4型(FAdV-4)毒株CH/HNJZ/2015(GenBank登錄號：KU558760)由河南農業大學傳染病實驗室保存；總RNA提取試劑盒購自TIANGEN；反轉錄試劑購自TOYOBO；質粒提取和DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；常規PCR試劑、pMD-18T vector、SYBR Green Ⅰ 染料和DNA Marker均購自TaKaRa。

1.2 方法

1.2.1 雞NLRP3基因的RT-PCR擴增和標準質粒的制備 根據GenBank數據庫中雞NLRP3基因序列(GenBank登錄號：KF318520.1)，設計雞NLRP3熒光定量特異性引物，qNLRP3-F：5′-TGAGGATTTGGACACCTTCCACCT-3′和qNLRP3-R：5′-TGCTTGATGCAGAAGCAAAGAGCC-3′。利用總RNA提取試劑盒，提取4周齡SPF雞肝總RNA，并反轉錄成cDNA。使用特異性引物進行RT-PCR擴增180 bp的NLRP3基因片段。將擴增片段連接到pMD-18T載體，構建pMD-18T-NLRP3重組質粒，測定質粒濃度并根據換算公式計算出重組質粒的拷貝數：拷貝數(copies·μL-1)=[6.02×1023×(質粒濃度ng·μL-1×10-9)]/[DNA長度(bp)×660]。

1.2.2 雞NLRP3熒光定量PCR的建立 以標準質粒pMD-18T-NLRP3為模板，利用SYBR Green Ⅰ 染料和雞NLRP3熒光定量PCR特異性引物，進行熒光定量PCR擴增。以出現熒光的Cq值最小和相對熒光強度(RFU)最大及熔解曲線不出現非特異性擴增峰為標準，分別對引物終濃度、退火溫度和循環數進行優化。將標準質粒pMD-18T-NLRP3進行10倍倍比稀釋，取1.0×103～1.0×107copies·μL-1稀釋度的標準質粒作為模板，以最佳反應條件建立雞NLRP3實時熒光定量PCR標準曲線。

1.2.3 致病性禽腺病毒4型(FAdV-4)感染雞不同組織中NLRP3基因轉錄水平的檢測 60只4周齡SPF雞(購自山東昊泰實驗動物繁育有限公司)被隨機平均分成2組，FAdV-4感染組雞用105TCID50致病性FAdV-4毒株CH/HNJZ/2015經口服途徑感染，對照組口服PBS。FAdV-4感染雞在感染后4～6 d，相繼發病死亡。分別取發病/死亡雞和對照雞的心、肝、肺、脾、腎、腺胃和盲腸扁桃體等組織樣品，立即凍存于-80 ℃。利用RNA提取試劑盒提取各組織的總RNA，定量1 μg RNA反轉錄成cDNA。以cDNA為模板，利用建立的NLRP3熒光定量PCR檢測雞組織中NLRP3基因的轉錄水平。再利用GraphPad Prism5.0軟件進行單因子方差(One-way ANOVA)分析和t檢驗統計分析。**表示差異顯著(P<0.01)，***表示差異極顯著(P<0.001)。

2 結 果

2.1 雞NLRP3基因擴增和標準質粒的制備

以雞肝總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，使用常規PCR擴增NLRP3目的基因。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠進行檢測，可觀察到180 bp目的條帶，大小與預期相符合(圖1)。將PCR產物膠回收純化后連接至pMD-18T載體，經測序鑒定成功得到pMD-18T-NLRP3重組質粒。測定pMD-18T-NLRP3標準質粒濃度為233 ng·μL-1，利用計算公式計算出該標準品拷貝數約為7.5×1010copies·μL-1。

M. DL2000 DNA相對分子質量標準；1. 擴增的NLRP3基因；2.空白對照M. DL2000 DNA marker; 1.Amplified NLRP3 gene; 2.Blank control圖1 NLRP3基因的擴增Fig.1 Amplification of NLRP3 gene

2.2 雞NLRP3熒光定量 PCR的建立

經過一系列熒光定量反應條件的篩選，最終的反應體系為總體系20 μL，其中，SYBR?Prexim ExTaqTMⅡ 10 μL，無菌DEPC水6 μL，qNLRP3-F/R(10 μmol·L-1)各1 μL，模板2 μL。最佳反應條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 8 s，共40個循環；95 ℃ 10 s；65 ℃ 5 s；95 ℃ 5 s。在該條件下熔解曲線單峰，表明設計的引物特異性良好(圖2)。

利用1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103copies·μL-1稀釋度的標準品為模板進行熒光定量PCR。熒光定量結果顯示，以相對熒光強度(RFU)為縱坐標，循環數(cycle)為橫坐標建立的擴增曲線光滑，擴增效率好；熒光定量標準曲線顯示，以Cq值為Y、拷貝數為X建立的標準曲線方程為Y=-3.434lgX+37.777，相關系數R2為0.999，擴增效率E為95.5%，滿足R2>0.999，110%>E>90%。 標準曲線顯示質粒標準品拷貝數與Cq值之間具有良好的線性關系(圖2)。

A.擴增曲線；B.標準曲線(X為拷貝數)；C.熔解曲線；1～5. 1.0×107～1.0×103 copies·μL-1A. Amplification curve; B. Standard curve (X.Copies number); C. Melting curve；1-5. 1.0×107-1.0×103 copies·μL-1圖2 雞NLRP3 SYBR Green Ⅰ 實時熒光定量PCR標準曲線建立Fig.2 Establishment of standard curve of chicken NLRP3 SYBR Green Ⅰ real-time PCR

2.3 致病性FAdV-4感染雞不同組織中NLRP3基因轉錄水平的檢測

利用建立的雞NLRP3 SYBR Green Ⅰ 熒光定量PCR方法，對致病性FAdV-4感染雞和未感染對照雞各組織中NLRP3的轉錄水平進行測定。結果顯示，該方法能檢測出雞不同組織中NLRP3基因的轉錄，各組織中NLRP3的轉錄水平有所差異。FAdV-4感染雞肝和脾中NLRP3的轉錄水平極顯著(P<0.001)高于對照組，盲腸扁桃體和法氏囊中NLRP3的轉錄水平顯著(P<0.01)高于對照組(圖3)。在致病性FAdV-4感染雞的心、肝和脾組織中NLRP3的轉錄水平極顯著(P<0.001)高于法氏囊、肺、腎、腺胃和盲腸扁桃體，而心、肝、脾組織中NLRP3的轉錄水平差異不顯著。法氏囊中NLRP3的轉錄水平極顯著(P<0.001)高于肺、腎、腺胃和盲腸扁桃體，且盲腸扁桃體中NLRP3的轉錄水平極顯著(P<0.001)高于肺、腎和腺胃，腎中NLRP3的轉錄水平極顯著(P<0.001)高于肺和腺胃，肺和腺胃組織中NLRP3的轉錄水平差異不顯著。

組間比較，**. 差異顯著(P<0.01)； ***. 差異極顯著(P<0.001)。感染組組織間比較，不同字母表示差異極顯著(P<0.001).Comparison between groups, **. Significant difference (P<0.01); ***. Extremely significant difference (P<0.001). Comparison among organizations of infected group, different letters indicate significant differences (P<0.001)圖3 SYBR Green Ⅰ 實時熒光定量PCR檢測FAdV-4感染雞組織中的NLRP3基因轉錄水平Fig.3 SYBR Green I real-time PCR for quantitative detection of NLRP3 gene in FAdV-4-infected chicken tissues

3 討 論

炎癥小體既是宿主天然免疫應答的重要組成部分，同時也在病毒致病機制中發揮重要作用[17]。NLRP3炎性小體是天然免疫系統的重要調節劑，在正常細胞中保持較低的水平，然而，一些病原的刺激會引起NLRP3炎性小體的過度活化，從而誘發細胞炎性因子風暴導致機體的病理損傷[18-19]，NLRP3分子是NLRP3炎癥小體復合物的重要組成成分[20-21]，很多病毒感染與NLRP3炎癥小體的激活相關[22]。參與激活過程的病毒組分主要包括病毒核酸、離子通道蛋白和非結構蛋白等。如人腺病毒感染巨噬細胞可以導致IL-1β的快速釋放，這種反應依賴于NLRP3炎癥小體的形成和Caspase-1的活化[23-24]；流感病毒的RNA和M2通道蛋白均可激活炎癥小體[25-26]；腦心肌炎病毒的通道蛋白2B可以激活NLRP3炎癥小體[27]；豬瘟病毒的p7通道蛋白可激活豬巨噬細胞炎癥小體[28]；豬繁殖與呼吸綜合征病毒通過NLRP3炎癥小體活化誘導巨噬細胞表達IL-1β[29-30]。丙型肝炎病毒感染會刺激肝巨噬細胞中NLRP3炎癥小體活化產生IL-1β進而造成肝炎癥[31]。迄今為止，與病毒感染相關的NLRP3炎癥小體的研究報道主要集中在哺乳動物模型，而與禽類病毒感染相關的禽NLRP3炎癥小體的研究相對較少，主要原因是受限于禽類NLRP3炎癥小體相關分子的檢測方法和研究材料。Ye等[32]首次研究了中國三黃雞體內NLRP3的組織特異性表達圖譜和組織分布。陶志云等[33]開展了雞小腸上皮細胞的分離培養和NLRP3在該細胞中的表達研究。Wang等[34]證明新城疫病毒(NDV)可以激活小鼠和人巨噬細胞中的NLRP3和增加IL-1β的表達。Gao等[35]首次證實了NDV在感染的雞細胞中通過活化NLRP3/Caspase-1炎癥小體誘導IL-1β的高表達。建立雞NLRP3分子的檢測技術有助于研究其在禽病發生中的作用。目前國內外尚未見有關雞NLRP3分子實時熒光定量PCR檢測方法的報道。

自2015年5月份以來，由FAdV-4導致的雞HHS給我國養禽業造成了巨大損失。研究顯示，致病性FAdV-4感染雞的肝、肺、脾和法氏囊等組織存在嚴重的淋巴細胞變性、壞死等炎癥損傷，而且這些組織中IL-1β的表達量與未感染對照雞相比顯著升高[5-6]。鑒于NLRP3炎癥小體的活化與IL-1β的表達和分泌密切相關，本研究設計雞NLRP3特異性引物，建立了檢測雞NLRP3的 SYBR Green Ⅰ 熒光定量PCR方法，并利用該方法對致病性FAdV-4感染雞組織中NLRP3基因的轉錄水平進行了分析。結果顯示，所建立方法對雞NLRP3標準質粒的擴增曲線良好，標準品的拷貝數與Cq值呈現良好的線性關系，所設計的NLRP3引物可特異性擴增雞NLRP3基因。

應用所建立的SYBR Green Ⅰ 熒光定量PCR對致病性FAdV-4感染雞和正常雞組織中NLRP3基因的轉錄水平進行了檢測。結果顯示，該方法能檢測出不同組織中NLRP3基因的轉錄。與對照組比對發現，NLRP3分子在致病性FAdV-4感染雞肝、脾中的轉錄水平極顯著高于對照組，在盲腸扁桃體和法氏囊的表達顯著高于對照組，提示這些器官是致病性FAdV-4的主要靶器官。致病性FAdV-4感染發病雞的心、肝、脾和法氏囊組織中NLRP3的轉錄水平顯著高于其他組織，這也與筆者前期研究結果顯示的致病性FAdV-4感染雞的心、肝、脾和法氏囊組織中IL-1β的高水平表達，以及這些組織的嚴重炎癥損傷病變相一致。鑒于NLRP3炎癥小體在IL-1β成熟和分泌過程中扮演重要角色，而IL-1β又是炎癥反應的重要介質，筆者推測致病性FAdV-4的致病過程是通過激活NLRP3炎癥小體，進而導致炎癥因子IL-1β的過量表達和分泌，最終導致機體組織的組織炎癥損傷。

4 結 論

本研究建立了一種檢測禽腺病毒血清4型(FAdV-4)感染雞組織中NLRP3基因轉錄水平的實時熒光定量PCR方法，該方法能檢測雞不同組織中NLRP3基因的轉錄，檢測結果表明各組織中NLRP3的轉錄水平有所差異。致病性FAdV-4感染發病雞肝、脾、盲腸扁桃體和法氏囊中NLRP3的轉錄水平顯著高于未感染對照組(P<0.01)；NLRP3分子在致病性FAdV-4感染雞的心、肝、脾和法氏囊組織中的轉錄水平極顯著高于其他組織(P<0.001)。 本研究可為進一步研究雞NLRP3分子在FAdV-4致病機制中的作用提供方法和技術支持。