OCT4通過重編程轉錄組調節毛囊干細胞分化潛能

(1 青島大學醫學部基礎醫學院病理學系,山東 青島 266071； 2 青島市市立醫院病理科； 3 青島市中心醫院重癥醫學科)

利用基因工程技術能夠將一種細胞重編程并直接轉分化成另一種細胞[1-2]。我們的前期研究將這一技術應用于人毛囊干細胞(hHFMSC)，并成功地將其轉分化為紅細胞。過表達OCT4的hHFMSC在培養過程中從貼壁細胞中逐漸產生一類小而圓、易懸浮的新的細胞亞群，該細胞亞群經造血誘導培養和紅系生長因子刺激后能夠向成熟的紅細胞轉分化[3]。hHFMSC本身具有多向分化的潛能[4]，在轉導4個多潛能轉錄因子(OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc)后可以被重編程為誘導多能干細胞(iPSC)，而單獨轉導OCT4可以被誘導生成紅細胞，但OCT4重編程hHFMSC的機制尚未有研究。本研究在前期研究的細胞模型基礎上，利用轉錄組測序分析OCT4轉導后全基因轉錄組的改變，通過功能富集分析以及KEGG分析探索OCT4對各譜系細胞發育的核心調控作用，篩查OCT4下游靶基因，旨在探討OCT4重編程hHFMSC的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞樣本及培養方法

前期工作中分離并鑒定后獲得的hHFMSC；hHFMSCOCT4-adherent：應用含有OCT4cDNA的慢病毒載體pLV-EF1α-OCT4-IRES-EGFP以及含有表達pVSVG、gag-pol和rev包裝質粒共同轉導hHFMSC，并經OCT4基因表達鑒定的貼壁細胞；hHFMSCOCT4-floating：收集hHFMSCOCT4-adherent的上層培養液，離心重懸后獲得的懸浮細胞。

培養條件：hHFMSC接種于培養瓶或培養皿中，hHFMSCOCT4-adherent、hHFMSCOCT4-floating細胞接種于Matrigel包被的培養板上。3種細胞均用含體積分數0.10胎牛血清、10 μg/L堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的H-DMEM/F12培養液，置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2培養箱中恒溫培養。

1.2 RNA提取及測序

每組細胞準備3個重復的獨立樣本，送至上海歐易公司進行轉錄組測序。按照說明書的操作步驟，使用mirVana miRNA Isolation Kit提取各樣本總RNA，應用Agilent 2100 Bioanalyzer進行質檢，將RNA完整性編號(RIN)≥7的樣本被納入后續分析。富集的mRNA加入打斷試劑使其片段化，合成的雙鏈cDNA經純化、修復和連接測序接頭后進行PCR擴增，應用TruSeq Stranded mRNA LTSample Prep Kit構建文庫，通過Illumina HiSeq X Ten sequencer進行測序。

1.3 差異表達基因(DEGs)分析及富集計算

使用Trimmomatic軟件對Raw reads進行質控，將經去接頭、低質量數據和堿基過濾處理得到的Clean reads與參考基因組進行比對，使用cufflinks和DESeq軟件分別對基因表達進行定量和標準化，按照差異倍數(fold change，FC)>2或<-2以及P<0.05的標準篩選出DEGs。利用DAVID數據庫中的Function Annotation 工具對DEGs分別進行GO功能富集和KEGG信號通路富集分析。

1.4 統計學分析

利用R package計算Pearson相關系數及進行負二項分布檢驗。相關系數越接近1，表示樣本間的相似度越高；負二項分布檢驗用于擬合基因覆蓋的Reads數、校正由基因長度引起的誤差和對基因表達量的差異進行假設檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 基因轉錄本的差異分析

轉錄組測序結果顯示，與hHFMSC相比較，hHFMSCOCT4-adherent中共有4 283個DEGs，其中上調者2 401個，下調者1 882個；hHFMSCOCT4-floating中有6 106個DEGs，其中上調基因3 107個，下調基因2 999個；與 hHFMSCOCT4-adherent相比，hHFMSCOCT4-floating中篩選出1 940個DEGs，其中上調基因833個，下調基因1 107個。見圖1。表明各組細胞樣本中基因組轉錄本具有顯著差異，且懸浮細胞與hHFMSC相比DEGs數目最多；另外，同為OCT4轉導后的細胞，懸浮細胞與貼壁細胞亞群的轉錄本明顯不同，說明二者可能具有不同的分化潛能。

圖1 轉導OCT4后hHFMSC中DEGs的分布

2.2 DEGs的聚類分析

根據每組樣本DEGs的表達量繪制熱圖(圖2)進行水平聚類分析，結果顯示，各組內樣本水平聚類距離更近，而組間樣本聚類距離相對較遠，表明各組內樣本具有良好的重復性，組間樣本的基因表達量具有顯著差異。

圖2 DEGs的水平聚類分析

2.3 DEGs的功能富集分析

使用DAVID數據庫分別對生物過程、細胞組分和分子功能進行富集分析的結果顯示，貼壁細胞和懸浮細胞分別與hHFMSC相比，上調基因顯著富集于中胚層(胸腺、肢體、血管、肌肉、骨骼、心臟)及外胚層(內耳、腦、神經系統、皮膚、乳房)的器官發育及細胞分化生物過程中(圖3)。表明hHFMSC在轉導OCT4后獲得了更多方向的分化潛能，甚至可能具有跨胚層發育的潛能。使用DAVID數據庫對KEGG信號通路進行富集分析的結果顯示，貼壁細胞和懸浮細胞分別與hHFMSC相比，調節干細胞多潛能性的信號通路中分別有29個和31個基因表達上調，包括ID3、BMP4、KLF4、LEFTY2和MYC等。進一步說明轉導OCT4可能通過該通路調節hHFMSC的多潛能性。見表1。

2.4 OCT4靶基因的表達

在轉導OCT4之后，hHFMSCOCT4-adherent和hHFMSCOCT4-floating中OCT4(POU5F1)表達上調倍數分別為4 859.8和6 958.3倍，兩組分別有81和96個OCT4的下游靶基因表達發生改變，其中上調基因分別為48和38個，下調基因分別為33和58個；而hHFMSCOCT4-floating與hHFMSCOCT4-adherent相比，有26個OCT4靶基因表達發生改變，其中上調基因4個，下調基因22個。功能分析表明，與hHFMSC相比，hHFMSCOCT4-adherent 中有SOX5、LEFTY2等11個多潛能性相關靶基因表達上調，而hHFMSCOCT4-floating中有LEFTY2、STAT3等9個多潛能性相關靶基因表達上調；相比hHFMSCOCT4-adherent，hHFMSCOCT4-floating中HESX1、LEFTY2等5個多潛能性相關靶基因表達下調。研究結果表明，OCT4轉入 hHFMSC后，對基因轉錄組進行了重編程，通過上調其他多潛能性基因使細胞獲得更多分化潛能。另外，促紅細胞生成基因CA2和胚胎造血相關基因KDR在貼壁細胞以及懸浮細胞中表達均上調，說明CA2、KDR基因在OCT4促進造血譜系分化的過程中可能發揮重要的作用。直接與hHFMSCOCT4-adherent進行比較，hHFMSCOCT4-floating中部分多潛能相關基因的表達下調，同時，KDR基因表達繼續上調，另一個造血相關靶基因HIST1H3D表達也上調，結果表明hHFMSCOCT4-floating可能丟失一定的多潛能性，并同時獲得造血譜系分化傾向(圖4)。

圖4 與多潛能性和造血相關的OCT4靶基因的表達

3 討 論

OCT4是維持干細胞自我更新的重要轉錄因子，可以與靶基因啟動子區結合激活其表達[5-6]，包括維持胚胎干細胞自我更新有關基因的表達[7]。在調節細胞多潛能性的基因網絡中，OCT4發揮核心調控作用[8-10]。OCT4可結合自身基因及其他多潛能性基因NANOG、SOX2、SALL4等的啟動子并調節其轉錄表達[5-6]；另一方面，OCT4與抑制性基因的啟動子相結合可抑制其轉錄激活，而這些抑制性基因的主要功能是促進譜系特異性分化[11-12]。已有研究證實，OCT4表達下調時，與內胚層譜系發育和細胞分化相關的基因轉錄水平顯著升高[13]，因此OCT4對于胚胎干細胞多潛能性的維持和成體細胞重編程均具有關鍵作用[14-15]。此外，最近有研究結果證實，單獨轉導OCT4即可賦予成纖維細胞向三胚層譜系轉分化的“可塑性”(不是完全去分化的多潛能性)，即轉導OCT4可以上調造血、神經發育及內胚層發育相關基因的表達，在進一步的譜系特異性信號刺激下分別向中胚層(造血祖細胞)和外胚層(神經祖細胞)分化[16-17]。并且，與其他多潛能基因(NANOG或SOX2)相比，只有過表達OCT4才能產生全新的中間狀態細胞(非iPSC)，并形成造血樣克隆(表達CD45)[18]，表明OCT4對于體細胞向造血譜系分化具有重要作用。

繼轉導多個轉錄因子重編程體細胞使其獲得多潛能性后[19-20]，近些年研究發現，單獨轉導OCT4就可重編程體細胞[21]。之前研究中，需要通過慢病毒向體細胞中轉導多個重編程基因，其誘導過程復雜，而且導入多因子可能影響基因組穩定性，因此應用具有一定局限性。hHFMSC來源于毛囊，具有來源豐富、獲取簡單、無免疫原性等應用優點[12]，因此可以作為基因工程細胞進行重編程、轉分化等研究。本研究通過RNA測序在轉錄水平檢測轉導OCT4后轉錄組的變化，探討OCT4對hHFMSC分化潛能的影響及其分子機制。

本研究中，單獨轉導OCT4入hHFMSC后產生貼壁細胞和懸浮細胞兩個亞群，與hHFMSC相比，這兩種細胞的基因轉錄本均發生顯著變化，篩選出DEGs并進一步進行功能分析顯示，上調DEGs顯著富集于外胚層和中胚層各器官發育及細胞分化的生物過程中，并且顯著富集于調節干細胞多潛能性的信號通路中，說明OCT4重編程的細胞亞群獲得了跨譜系、跨胚層分化的多潛能性。直接比較貼壁細胞和懸浮細胞則顯示，這兩種細胞為相對獨立的亞群，具有差異顯著的轉錄組，盡管其差異性不及OCT4轉導前后的變化。本研究結果還顯示，懸浮細胞亞群中OCT4的上調倍數明顯高于貼壁細胞，推測OCT4的較高表達量可能與懸浮細胞的產生有關；另一方面，貼壁細胞經過傳代培養后黏附性降低、細胞變圓，而懸浮細胞也可以重新貼壁培養并形成集落[3]，說明兩種亞型之間能相互轉化衍生，其具體機制尚待研究。對OCT4下游靶基因進行分析表明，hHFMSC中OCT4可能通過上調多潛能性相關靶基因LEFTY2、SOX5、FGFR2及STAT3等的表達，使hHFMSC重編程并獲得更多的分化潛能，而懸浮細胞中一部分多潛能性靶基因表達量下降，表明該細胞亞群的自我更新與分化的平衡有所傾斜，可能更易于發生轉分化。在OCT4的靶基因中，胚胎造血相關基因KDR與紅系生成相關基因CA2及造血基因HIST1H3D均表達上調，說明懸浮細胞具有一定的紅系分化傾向。因此，在給予造血相關細胞因子刺激后，懸浮細胞最終能夠轉分化為成熟的紅細胞[3]。然而，懸浮細胞與貼壁細胞多潛能性及其他生物學功能的差異仍需進一步探討，OCT4轉導后的細胞具有哪些組織特異性細胞分化能力也需進行相關研究證實。

本研究通過RNA測序方法探討過表達OCT4后hHFMSC基因轉錄組的變化及其對分化潛能的影響，尋找OCT4通過調控靶基因表達使體細胞去分化的分子依據，為hHFMSC在基因工程研究中的應用奠定了基礎，也為臨床應用干細胞進行個體化治療提供了新的細胞來源。