蟾毒靈對低氧/復氧心肌細胞損傷保護作用及機制

(河南大學第一附屬醫院心內科,河南 開封 475000)

急性心肌梗死是冠狀動脈持續性缺血低氧引起的心肌壞死，當冠狀動脈血運重建時可能誘發缺血/再灌注損傷[1-2]。如何減少缺血/再灌注造成的心肌細胞損傷一直以來是心血管疾病臨床和基礎研究的重點。蟾毒靈是一種從傳統中藥蟾酥中提取的中藥單體，具有抗炎、鎮痛、強心、抗腫瘤等多種臨床功效[3-4]。有研究顯示，蟾酥能夠改善缺血心肌細胞的能量代謝，在一定濃度范圍內呈濃度依賴性地抑制大鼠心肌細胞收縮，減輕心肌損傷，對心肌具有保護作用[5-6]。然而，蟾毒靈在心肌缺血/再灌注損傷中是否發揮作用的研究鮮有報道。因此，本實驗通過體外構建低氧/復氧(H/R)心肌細胞損傷模型，觀察蟾毒靈對H/R損傷心肌細胞的影響及機制，為利用蟾毒靈防治心肌H/R損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大鼠心肌細胞株H9c2購自中國科學院上海生命科學學院細胞資源中心；蟾毒靈(純度≥98%)購自煙臺靶點藥物研究有限公司；DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；CCK-8細胞活力檢測試劑盒購自北京曠博生物技術有限公司；活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；Western blot檢測所需試劑均購自上海碧云天生物技術研究所；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3和9(Cleaved Caspase-3，Cleaved Caspase-9)抗體購自美國Santa Cruz公司；β-actin抗體和辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國CST公司。

1.2 實驗方法

1.2.1H/R心肌細胞模型的構建 在含體積分數0.10胎牛血清的DMEM培養基中培養心肌細胞H9c2，放置在體積分數0.05 CO2、0.95空氣、37 ℃恒溫培養箱中培養。參照文獻方法構建H/R心肌細胞模型[7]，待心肌細胞生長達60%左右融合時，除去舊培養液，加入不含血清的新鮮DMEM培養液，將心肌細胞放置在體積分數0.95 N2和0.05 CO2培養箱中低氧處理12 h，取出細胞，棄去舊培養液，更換成含體積分數0.10胎牛血清的DMEM培養液，再將細胞放置在體積分數0.05 CO2、0.95空氣的培養箱中復氧處理4 h。

1.2.2實驗分組 心肌細胞接種到6孔板中，將細胞隨機分為5組：空白對照組(A組)，未經任何處理正常培養的心肌細胞；H/R組(B組)，按照上述1.2.1方法對心肌細胞進行H/R處理；低濃度蟾毒靈組(C組)，以0.1 μmol/L蟾毒靈預處理心肌細胞12 h再行H/R處理；中濃度蟾毒靈組(D組)，以1.0 μmol/L蟾毒靈預處理心肌細胞12 h再行H/R處理；高濃度蟾毒靈組(E組)，以10.0 μmol/L蟾毒靈預處理心肌細胞12 h再行H/R處理。蟾毒靈處理濃度選擇依據文獻報道及前期預實驗結果[8]。

1.2.3CCK-8檢測心肌細胞活力 將心肌細胞以每孔1×103個接種于96孔板中，置37 ℃培養箱常規培養48 h，按照上述1.2.2方法分組處理心肌細胞，分別向每孔細胞中添加10 μL CCK-8試劑和100 μL無血清培養液，于37 ℃培養箱孵育2 h，采用酶標儀測定450 nm波長處各孔心肌細胞光密度值(OD值)。計算各組心肌細胞活力(%)=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.4酶標法檢測細胞內SOD和MDA含量 各組心肌細胞處理后，棄去培養液分別收集細胞，使用磷酸緩沖液洗滌細胞，通過超聲破碎儀破碎細胞，以3 500 r/min低溫離心10 min，收集上清，分別按照試劑盒說明書進行處理。采用多功能酶標儀測定各組心肌細胞內SOD和MDA含量。

1.2.5流式細胞術檢測各組心肌細胞凋亡率 各處理組心肌細胞以胰蛋白酶消化后，離心收集細胞，用預冷的磷酸緩沖液洗滌細胞。按照Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒使用說明書進行操作，加入1×Binding buffer重懸細胞100 μL，再向細胞懸液中加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各5 μL，輕輕混勻，室溫下避光孵育15 min。使用流式細胞儀測定各組心肌細胞凋亡率。

1.2.6流式細胞術檢測ROS水平 將熒光探針DCFH-DA以不含血清的培養液稀釋。各處理組心肌細胞除去培養液，分別加入稀釋的DCFH-DA，置37 ℃培養箱孵育30 min，用不含血清的培養液洗滌細胞3次，除去DCFH-DA。收集各組細胞上流式細胞儀使用488 nm激發波長和525 nm發射波長檢測熒光強度。

1.2.7Western blot檢測各組心肌細胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達水平 分別收集各組處理后的心肌細胞，向細胞中加入RIPA裂解液，冰上提取總蛋白。以BCA蛋白濃度測定試劑盒對提取蛋白進行定量，調整蛋白濃度，取等量蛋白加入到各上樣孔中，采用SDS-PAGE凝膠進行電泳，電泳結束后將各組蛋白采用半干法轉移至PVDF膜上。將PVDF膜放置于50 g/L脫脂奶粉封閉液中孵育2 h，取出膜使用TBST洗滌3次，每次10 min，再加入稀釋的相應一抗，Cleaved Caspase-3和-9一抗均為1∶800稀釋，4 ℃過夜孵育。以TBST洗滌3次，每次10 min，再加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育1 h。以TBST洗滌3次，每次10 min，在暗室中加入ECL化學發光液進行顯影，曝光，采用凝膠成像儀拍照。以β-actin為內參照，采用Quantity One圖像分析軟件統計各組心肌細胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組心肌細胞活力比較

CCK-8檢測結果顯示，A～E組心肌細胞活力分別為(100.00±5.01)%、(39.84±2.12)%、(49.28±3.44)%、(64.71±4.81)%和(87.01±4.69)%。與A組比較，B組心肌細胞活力顯著下降(F=330.050，q=43.377，P<0.05)；與B組相比較，C、D、E組心肌細胞活力有不同程度的升高(q=6.804～34.011，P<0.05)。提示隨蟾毒靈濃度的增加心肌細胞活力逐漸升高。

2.2 各組心肌細胞內ROS水平、SOD和MDA含量比較

酶標法和流式細胞術檢測結果顯示，與A組比較，B組心肌細胞內SOD含量降低(F=129.978，q=28.673，P<0.05)，ROS水平和MDA含量升高(F=171.502、178.726，q=33.623、31.443，P<0.05)；與B組比較，C、D、E組心肌細胞內SOD含量隨藥物濃度的增加而增加(q=4.144～17.689，P<0.05)，ROS水平和MDA含量隨藥物濃度的增加而降低(q=7.893～27.065，P<0.05)。見圖1。

①流式細胞術檢測ROS水平；②酶標法檢測SOD含量；③酶標法檢測MDA含量。與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05；與D組比較，dP<0.05。

2.3 各組心肌細胞凋亡率比較

流式細胞術檢測結果顯示，A～E組心肌細胞凋亡率分別為(3.81±0.66)%、(35.69±5.35)%、(27.04±3.29)%、(18.48±2.84)%和(9.26±1.15)%。與A組比較，B組心肌細胞凋亡率顯著升高(F=152.747，q=30.467，P<0.05)；與B組比較，C、D、E組心肌細胞凋亡率隨藥物濃度的增加逐漸降低(q=8.267～25.259，P<0.05)。見圖2。

圖2 流式細胞術檢測各組心肌細胞凋亡率

2.4 各組心肌細胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達水平比較

Western blot檢測結果顯示，與A組比較，B組心肌細胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達水平均明顯上調(F=211.749、217.378，q=32.577、37.566，P<0.05)；與B組比較，C、D、E組心肌細胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達水平隨藥物濃度的增加逐漸下調(q=6.831～25.469，P<0.05)。見圖3。

①Western blot檢測各組心肌細胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達水平；②各組心肌細胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達水平比較。與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05；與D組比較，dP<0.05。

3 討 論

急性心肌梗死是常見的心血管疾病，美國每年約有150萬人發病[9]。近年來，我國急性心肌梗死的發病率呈明顯上升趨勢，嚴重危害著人類的健康和生命[10]。臨床上常通過血運重建的方式縮小梗死面積，挽救心肌，但血運重建會導致缺血/再灌注損傷的發生。目前關于心肌缺血/再灌注損傷的發生機制尚未徹底闡明，認為可能與氧自由基的作用、細胞凋亡過程紊亂、細胞內鈣超載和白細胞的激活等相關[11-14]。研究證實，細胞凋亡過程的紊亂是病理性的，而且與Caspase基因有關[15]。在目前用于心肌缺血/再灌注損傷的新型治療劑中，各種天然植物化學物質可通過各種途徑對心肌損傷起保護作用[16-17]。研究已證實，蟾酥提取物對心力衰竭、缺血性心肌病和高血壓等心血管疾病的治療具有重要作用[18-20]。作為蟾酥中的有效化學物質，蟾毒靈具有多種生物活性。本實驗通過建立H/R心肌細胞損傷模型，探究蟾毒靈對心肌細胞損傷的影響及機制。

在預實驗中依據文獻報道篩選蟾毒靈的作用濃度[8]，研究結果顯示，當蟾毒靈濃度≤10.0 μmol/L時，能夠促進心肌細胞增殖活性；當蟾毒靈濃度>30.0 μmol/L時，則抑制心肌細胞增殖活性。因此，本實驗根據預實驗結果選擇0.1、1.0、10.0 μmol/L為實驗加藥濃度。本文結果表明，H/R損傷顯著降低了心肌細胞的活力，而蟾毒靈明顯逆轉了H/R誘導的細胞活力降低。越來越多的研究結果已經證實，氧化應激在心肌缺血/再灌注損傷中起關鍵作用[21-23]。心肌細胞中的氧化劑和抗氧化劑失衡有利于ROS積累，導致細胞損傷，引起氧化應激[24]。已證明，在心肌缺血/再灌注損傷期間ROS水平增加，內源性自由基清除酶如SOD活性降低[25-27]。眾所周知，活性醛如MDA是氧化應激最常見的產物和毒性標志物之一。心肌缺血/再灌注損傷促進氧化應激，引起活性醛積累，導致心臟損傷[28]。因此，通過檢測心肌細胞中ROS水平、SOD活性以及MDA含量能夠顯示心肌細胞的氧化損傷程度。本實驗酶標法檢測結果顯示，蟾毒靈處理的心肌細胞內SOD活性增加，ROS和MDA含量減少，且具有濃度依賴關系。這些結果提示，蟾毒靈對H/R條件下心肌細胞氧化應激損傷具有保護作用。

心肌細胞凋亡過程的紊亂被認為是心肌缺血/再灌注損傷的主要病理生理機制之一，并且被認為是導致心肌缺血/再灌注損傷后細胞死亡的重要原因[29]。本研究流式細胞術檢測顯示，蟾毒靈處理組的心肌細胞凋亡率明顯低于H/R處理組，且隨著蟾毒靈濃度的升高，心肌細胞凋亡率逐漸降低，表明蟾毒靈能夠呈濃度依賴性地抑制H/R誘導的心肌細胞凋亡。此外，本文Western blot檢測顯示，蟾毒靈處理組心肌細胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達水平明顯低于H/R處理組。Caspase-3和-9作為半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶家族成員，在細胞凋亡中起關鍵作用。特定位點的切割將激活Caspase-3和-9并促進細胞凋亡[30]。本文結果提示，蟾毒靈可能通過下調Cleaved Caspase-3和-9的蛋白表達抑制心肌細胞凋亡，對H/R心肌細胞損傷起保護作用。

總之，本研究的結果揭示了蟾毒靈對H/R損傷心肌細胞具有保護作用，其作用機制與降低氧化應激及細胞凋亡有關。初步證實蟾毒靈的心肌保護作用和潛在機制，這些結果為體內作用進一步評估提供了證據，這可能有助于開發新的治療急性心肌梗死的方法。本實驗初步探究蟾毒靈是否對H/R心肌細胞起保護作用，其作用效果在何種水平尚未可知，后期實驗將設置已知有效藥物的陽性對照組，以更深入明確其作用的分子機制。此外，為更充分了解蟾毒靈作用，需增加H/R后蟾毒靈不同濃度和不同時間點對細胞作用，闡述蟾毒靈是否在發病后有一定的抑制氧化、凋亡和促進修復的作用。