外源添加單一氨基酸對桑葚酒風味品質的影響

張雙梅，鄭瑩媛，張秀艷*

（1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.華中農業大學環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

桑葚（Fructus mori）屬于藥食同源漿果，因不耐貯藏而常被加工成果酒等產品。桑葚酒不僅營養豐富且具健康功效，因此受到消費者青睞[1]。然而，桑葚酒存在風味單一的問題[2]，這必將影響桑葚酒在果酒市場的競爭力。果酒風味化合物的種類和含量是影響果酒風味復雜性的重要因素，它受發酵微生物、發酵工藝和果汁化學組成等的影響，因此可通過優選酵母菌株、優化發酵工藝、優化果汁組成等解決果酒風味單一問題[3-5]。

酵母種類及發酵工藝是影響果酒風味的重要因素。研究表明，利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和非釀酒酵母（non-Saccharomyces）混合發酵可有效改善葡萄酒、櫻桃酒、榴蓮酒和甘蔗酒等果酒的風味和品質[6-9]。優化酵母接種量及其發酵條件等也可改善果酒風味品質[10-11]。氨基酸的種類及濃度對果酒香氣的復雜性具有重要影響[12]。漿果中的氨基酸是酵母可同化氮的主要來源之一，可被酵母吸收并用于生長和產生代謝產物，如產生高級醇及酯類物質[13]。不同氨基酸經微生物代謝后可產生不同風味物質進而影響果酒的風味和品質，如支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸）與苯丙氨酸可顯著提高葡萄酒中相應高級醇及其乙酸酯的含量[14]。GUTIéRREZ A等[15]研究發現，在酵母生長穩定期添加精氨酸，可促進酯類物質的生成。增加果汁中蘇氨酸含量，則可增加果酒中異戊醇、苯乙醇、乙酸、丙酸的含量，并降低異丁醇的含量[16]。

項目組在前期研究中發現，庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）F2-24與釀酒酵母混合發酵可以顯著改善桑葚酒的風味品質。同時，相對于葡萄汁的氨基酸含量，大十桑葚汁所含氨基酸較少，尤其是對香氣影響較大的纈氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸的含量[17]。由此推斷，桑葚汁中氨基酸濃度低可能是造成桑葚酒風味單一的原因。鑒于此，本研究在桑葚汁中分別添加纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸及苯丙氨酸，并采用P.kudriavzeviiF2-24與釀酒酵母混合發酵桑葚酒，以不添加氨基酸的混合發酵桑葚酒為對照，通過對桑葚酒的理化指標、揮發性風味物質及感官品質進行分析，探究外源添加單一氨基酸對桑葚酒風味品質的影響，以期為高品質桑葚酒開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大十桑葚：來自湖北省武漢市黃陂區，含糖量115.24g/L，含酸量16.75 g/L（以酒石酸計）。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SC：法國LAFFORT公司；庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）F2-24：本實驗室保藏。

1.1.2 試劑

異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸：合肥蘭杰科技有限公司；H2SO3、NaCl、環己酮：國藥集團化學試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-IF超凈工作臺：蘇中凈化設備有限公司；TQ8040型氣相色譜質譜聯用儀：日本島津公司；固相微萃取針頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS：美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 桑葚酒的發酵流程及操作要點

桑葚除梗破碎→巴氏殺菌→浸漬→發酵→過濾→裝瓶→陳釀→桑葚酒

操作要點：桑葚除梗破碎后得到桑葚醪，將其裝入15個250 mL發酵瓶中（裝液量為80%）。向發酵瓶中分別單獨添加400 mg/L的異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸（發酵酒分別命名為Ile-w，Leu-w，Phe-w，Val-w），以不添加氨基酸的發酵酒作為對照（Control）。將裝有醪液的發酵瓶置于水浴鍋中加熱至80 ℃保持45 min，取出冷卻后加入60 mg/L SO2，混勻置于4 ℃冰箱過夜。按照1×106CFU/mL的接種量，同時在桑葚醪中接入活化的庫德里阿茲威氏畢赤酵母F2-24和釀酒酵母SC（1∶1）進行混合發酵（20 ℃），直至殘糖＜4 g/L（以還原糖計）即進行壓榨過濾，在上清液中加入50 mg/L SO2后裝入無菌瓶中在4 ℃貯藏。每種酒樣做3個重復。

1.3.2 理化指標分析

還原糖采用3,5-二硝基水楊酸法測定[18]；酒精度采用快速氧化法測定[19]；總酸和揮發酸的測定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.3 揮發性風味物質分析

樣品處理：取8 mL酒樣移入20 mL頂空瓶中，加入2.00 g NaCl，加入10 μL環己酮（0.4 mg/L）作為內標物，在40 ℃條件下于恒溫磁力攪拌器中平衡15 min，萃取30 min，后插入GC進樣口解吸5 min。

色譜條件：DB-5石英毛細管柱（30m×320 μm，0.25 μm），程序升溫：起始溫度40 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升至130 ℃，然后以4 ℃/min升至250 ℃保持5 min，進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度260 ℃。

質譜條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，燈絲發熱電流0.25 mA，離子源溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度250 ℃，質量掃描范圍為30～350 amu。

定性定量分析：通過質譜計算機的Wiley、Nistdemo質譜庫定性，各香氣物質組分的質譜經計算機譜庫檢索，結合解析譜圖，確定香氣物質。采用內標法進行定量。

1.3.4 感官分析

感官分析參照BELDA I等[20]的方法，評議小組由10名成員（6名女性和4名男性）組成，年齡為25～46歲。在室溫且通風良好條件下對酒樣的外觀、香氣和口感進行評價。評分等級中的分數表示特性的有無和強弱。其中，“0”表示無此特征，“1～2”表示非常弱，“3～4”表示弱，“5～6”表示中等，“7～8”表示強，“9”表示非常強。

1.3.5 數據處理

數據統計和作圖由Microsoft Office 2016和GraphPad Prism 6.0執行。單因素方差分析通過SPSS 19.0完成。利用Multi Experiment Viewer 4.9.0對所有風味物質和酒樣進行聚類分析和熱圖可視化分析。

2 結果與分析

2.1 桑葚酒理化指標分析

桑葚酒理化指標分析見表1。由表1可知，外源添加異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸對桑葚酒的酒精度、總酸和揮發酸無顯著影響（P＞0.05），顯著降低其殘糖含量（P＜0.05）。說明外源添加氨基酸對桑葚酒的理化指標無明顯影響，這與ZHONG X F等[21]的研究結果一致。

表1 添加單一氨基酸的桑葚酒的理化指標Table 1 Physiochemical indexes of mulberry wine with single amino acid addition

2.2 桑葚酒的揮發性風味物質分析

桑葚酒揮發性風味成分及含量測定結果見表2。由表2可知，不同氨基酸添加的桑葚酒中共檢測到40種風味化合物，包括7種品種香氣化合物和33種發酵香氣化合物。與未添加氨基酸的混合發酵葡萄酒的揮發性風味物質含量相比（36.07 mg/L），添加異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及纈氨酸均顯著提高了桑葚酒的揮發性風味物質含量（42.38～84.58 mg/L）（P＜0.05）。

表2 添加單一氨基酸的桑葚酒中揮發性風味物質含量Table 2 Contents of volatile flavor compounds in mulberry wine with single amino acid addition mg/L

續表

2.2.1 品種香氣化合物分析

由表2可知，酒樣中共檢測到7種品種香氣化合物，包括1種C6化合物，5種萜烯類和1種C13-降異戊二烯類化合物，其中風味活性化合物（OAV＞1）有芳樟醇、香茅醇、香葉醇、香葉基丙酮和β-紫羅蘭酮。與Control相比，Ile-w中芳樟醇和香茅醇含量顯著增加（P＜0.05），1-己醇含量顯著減少（P＜0.05）；Leu-w中芳樟醇和香茅醇含量顯著增加（P＜0.05）；Phe-w中β-紫羅蘭酮含量顯著增加（P＜0.05）；而Val-w中風味活性化合物含量降低（P＜0.05），1-己醇含量顯著增加（P＜0.05）。另外，除Phe-w中品種香氣化合物含量顯著降低（減少了0.08 mg/L）外，Ile-w、Leu-w和Val-w中品種香氣化合物的含量無明顯變化。這說明，外源添加氨基酸僅會影響部分品種香氣化合物的含量，對品種香氣的總含量影響較小。

2.2.2 發酵香氣化合物分析

由表2可知，33種發酵香氣化合物中包括了9種高級醇類，6種乙酸酯類、8種脂肪酸乙酯類、1種其他酯類、6種脂肪酸類和3種醛酮類化合物，其中風味活性化合物（OAV＞1）有1-壬醇、正庚醇、辛烯醇、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸、壬醛、癸醛和苯乙醛。與對照相比，Ile-w、Leu-w、Phe-w和Val-w中發酵香氣化合物，尤其是高級醇類和乙酸酯類化合物的含量顯著提高（P＜0.05）。Ile-w中活性戊醇和乙酸活性戊酯的含量顯著提高（P＜0.05），分別為40.67 mg/L和4.82 mg/L，但其異戊醇含量顯著降低（P＜0.05）。Leu-w中異戊醇和乙酸異戊酯含量顯著增加（P＜0.05），分別為45.20 mg/L和10.42 mg/L，但活性戊醇含量顯著降低（P＜0.05）。Phe-w中苯乙醇和乙酸苯乙酯含量顯著增加，分別為47.46 mg/L和4.79 mg/L，且苯乙醇含量是對照的9.89倍。Val-w中異丁醇和乙酸異丁酯含量顯著提高（P＜0.05），其異丁醇為9.70 mg/L，乙酸異丁酯含量為對照的5.50倍。這主要是因為添加的亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸分別為異戊醇、活性戊醇、苯乙醇和異丁醇的前體物，因此在桑葚酒中單一添加不同種類氨基酸可增加相應高級醇的含量，從而提高其相應的酯類物質含量，這與LYUMUGABE F等[31-32]所報道的一致。

此外，添加不同種類氨基酸不僅可提高桑葚酒中對應高級醇及其酯的含量，還可對異丁醇、1-壬醇、正庚醇、乙酸丙酯和辛酸乙酯等化合物的含量產生顯著影響。如除Val-w外，添加其他種類氨基酸的桑葚酒中異丁醇含量均增加，Phe-w和Val-w中1-壬醇含量顯著增加（P＜0.05），Ile-w和Leu-w中正庚醇含量顯著降低（P＜0.05），而Val-w中乙酸丙酯含量顯著增加（P＜0.05）。同時，添加異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸均可提高辛酸乙酯的含量。

2.3 桑葚酒的揮發性風味物質聚類分析

桑葚酒的40種揮發性風味化合物的聚類分析結果如圖1。結果表明，5種桑葚酒被分為2類，Ile-w和Leu-w聚為一類，Control、Phe-w和Val-w聚為一類。40種風味物質被分為5類，分別命名為Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類、Ⅳ類和V類風味化合物。Control富含部分Ⅱ類風味化合物（苯乙醛、壬醛、正庚醇和辛酸）和部分Ⅳ類風味化合物（己酸、1-己醇和1-辛醇）。Ile-w富含全部Ⅰ類風味化合物（香茅醇、乙酸丁酯、乙酸活性戊酯、活性戊醇和2-甲基丁酸）和部分V類風味化合物（芳樟醇、松油醇和9-癸烯酸乙酯）。Leu-w富含全部V類風味化合物，包括芳樟醇、松油醇、香葉基丙酮、壬酸乙酯、庚酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯等萜烯類化合物和酯類化合物。Val-w富含全部Ⅳ類風味化合物（異丁醇、乙酸丙酯、乙酸異丁酯、異丁酸等）、部分Ⅱ類風味化合物（壬醛、正庚醇、1-壬醇、辛酸和癸酸）和部分V類風味化合物（松油醇、壬酸乙酯和庚酸乙酯等）。Phe-w富含全部Ⅱ類和Ⅲ類風味化合物，包括癸醛、苯乙醛、苯乙醇、香葉醇、β-紫羅蘭酮、乙酸苯乙酯、丁酸乙酯和月桂酸乙酯等化合物。由此可知，單一添加氨基酸除了影響與其代謝直接相關的高級醇及酯類物質的含量外，也會影響其他香氣化合物的代謝?？傊?，與對照相比，單一添加氨基酸增加了桑葚酒萜烯類、高級醇類及酯類物質的種類與含量。

圖1 添加單一氨基酸的桑葚酒中揮發性風味物質聚類分析Fig. 1 Cluster analysis of volatile flavor compounds in mulberry wine with single amino acid addition

2.4 桑葚酒的感官評定結果

添加單一氨基酸的桑葚酒感官評定結果見圖2。結果表明，所有桑葚酒的外觀無顯著差異（P＞0.05），平均分數均在5.0～5.5分，外觀均為紫紅色、澄清且有光澤。氨基酸的添加降低了桑葚酒中不良的草本味，這可能與酒樣中C6化合物等具有生青味物質減少有關。添加不同種類的氨基酸對桑葚酒的感官品質有不同的影響。Phe-w的花香評分較高，但其果香評分低于Control。與Control相比，Ile-w、Leu-w和Val-w果香評分較高，而花香并無顯著改變（P＞0.05）。此外，與Control相比，添加不同氨基酸的桑葚酒的口感評分均顯著提高（P＜0.05）。以上結果說明，添加單一氨基酸可以改良桑葚酒的感官品質，但可能會使桑葚酒某一香氣較為突出。這與HERNáNDEZ-ORTE P等[33]在使用釀酒酵母單獨發酵葡萄酒中添加單一氨基酸所得結果一致。

圖2 添加單一氨基酸的桑葚酒的感官評定結果Fig. 2 Sensory evaluation results of mulberry wine with single amino acid addition

3 結論

在桑葚汁中添加Ile、Leu、Phe和Val不影響桑葚酒的理化指標，但能顯著增加桑葚酒的揮發性風味物質含量（P＜0.05），尤其是發酵香氣化合物。不同氨基酸添加可顯著影響桑葚酒中不同類型風味化合物的含量，如添加異亮氨酸顯著增加了桑葚酒中活性戊醇、乙酸活性戊酯及辛酸乙酯的含量；添加亮氨酸顯著增加了桑葚酒中異戊醇、乙酸異戊酯及辛酸乙酯的含量；添加苯丙氨酸顯著增加了桑葚酒中β-紫羅蘭酮、苯乙醇及乙酸苯乙酯的含量，降低了1-己醇的含量；添加纈氨酸顯著增加了桑葚酒中異丁醇和乙酸異丁酯的含量（P＜0.05）。此外，外源添加氨基酸可顯著改善桑葚酒的感官品質，但過多添加單一氨基酸可能會導致桑葚酒風味失去平衡。研究結果將為桑葚酒風味品質的改良提供新思路，為其他果酒風味品質改良提供借鑒。