星形假絲酵母在強化赤霞珠葡萄酒玫瑰香氣中的應用

劉文翰，王 斌，姬茹婕，史學偉，程衛東*

（石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000）

傳統葡萄酒的釀造方式主要包括自然發酵和商業釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）純種發酵，自然發酵依靠葡萄表皮豐富多樣的微生物進行發酵，風味復雜，但發酵過程不容易控制，受環境因素影響較大[1]。因此，葡萄酒企業主要采用商業釀酒酵母進行純種發酵。商業釀酒酵母對酒精、SO2、溫度具有較強的耐受性，使用商業釀酒酵母進行純種發酵可以保證葡萄酒發酵的順利進行，但容易導致葡萄酒風味同質化[2]。葡萄酒香氣是評價葡萄酒質量的重要感官指標之一，分為品種香氣、發酵香氣和陳釀香氣[3]。品種香氣來源于葡萄果實中的揮發性香氣物質，受葡萄種植環境影響，具有一定地域特色；發酵香氣來源于發酵過程中（釀酒酵母和非釀酒酵母）和其他微生物的代謝[4]。葡萄酒發酵過程中，釀酒酵母將釀酒葡萄中的糖轉化為酒精，形成葡萄酒的主體，而非釀酒酵母對葡萄酒風味具有重要調節作用[5]。不同的酵母菌株在發酵過程中會產生不同的揮發性香氣物質，包括高級醇、酯類、脂肪酸類及萜類化合物等，這些物質對葡萄酒的風味及感官特性有重要的影響[6]。

非釀酒酵母是除釀酒酵母外多種酵母類群的統稱[7]。非釀酒酵母最早是從腐敗的葡萄酒中分離得到的，被看作是葡萄酒發酵中的有害微生物，且會對葡萄酒的品質帶來負面影響[8]。然而，近些年的研究表明，由于非釀酒酵母的獨特代謝活動，非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵的葡萄酒中香氣物質含量顯著高于釀酒酵母純種發酵[9]。非釀酒酵母可以產生大量的酯類、高級醇，以及其他揮發性化合物，有利于提升葡萄酒的香氣、風味等感官特征，但也可能在發酵過程中產生不良的氣味對葡萄酒的感官品質帶來負面影響[10]。葡萄酒企業迫切需要找到新的釀造方式來改善葡萄酒的感官品質。有研究表明，利用釀酒酵母與非釀酒酵母混合發酵對葡萄酒的感官品質有積極的影響[11]。過高的酒精度對葡萄酒的口感及風味存在負面影響，并且可能存在健康安全隱患[12]。星形假絲酵母具有相對較低的酒精轉化率，利用星形假絲酵母和美極梅奇酵母與釀酒酵母混合發酵可以降低葡萄酒中的乙醇含量[13]。有機酸是葡萄酒中重要的風味物質，主要來源于葡萄果實和酵母代謝[14]。星形假絲酵母單菌發酵或與釀酒酵母混合發酵能提高葡萄酒中琥珀酸的含量，對酸度不足的葡萄酒產生積極影響[15]。

揮發性風味物質是葡萄酒品質重要組成部分。苯乙醇是一種具有玫瑰香氣的揮發性化合物。本研究以星形假絲酵母（Candida astrulatum）X11和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CEC01單菌發酵、共同發酵和順序發酵制備赤霞珠葡萄酒，通過探討不同發酵方式對赤霞珠葡萄酒中玫瑰香氣的影響，避免赤霞珠葡萄酒風味的單一化。采用頂空固相微萃取結合氣相色譜與質譜聯用（headspace solid-phase microextractions gas chromatography mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）技術檢測赤霞珠葡萄酒中揮發性香氣成分，并對結果進行主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）及聚類分析（cluster analysis，CA）?？疾煨切渭俳z酵母X11對赤霞珠葡萄酒風味的影響，研究星形假絲酵母X11與釀酒酵母CEC01混菌發酵高品質葡萄酒的條件，為赤霞珠葡萄酒風味改善提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄（初始糖度253.14 g/L，pH值為3.85，總酸（以酒石酸計）3.8 g/L）：新疆張裕酒莊；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CEC01：安琪酵母股份有限公司；星形假絲酵母（Candida astrulatum）X11：石河子大學食品學院葡萄與葡萄酒研究中心分離、篩選及保藏。

偏重亞硫酸鉀（分析純）：上海研生生化試劑有限公司。酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone glucose，YPD）瓊脂培養基：葡萄糖2%，酵母浸粉1%，蛋白胨2%，瓊脂2%。121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

8890-5977B型氣質聯用儀：美國Agilent公司；PDMS/DVB/CAR萃取頭：美國Supelco公司；HWJB-2100AT恒溫磁力攪拌器：鄭州碳邦儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

釀酒酵母CEC01活化：一定量的蔗糖溶解在的蒸餾水中，完全溶解后，加入一定量釀酒酵母，活化20～30 min后，加入5倍酵母液的赤霞珠葡萄汁，培養2 h。

星形假絲酵母X11活化：將星形假絲酵母X11用接種環取2～3環接種于滅菌赤霞珠葡萄汁中（27 ℃、120 r/min）培養12 h；按體積比為1∶100將星形假絲酵母X11培養物接種于經處理的赤霞珠葡萄醪中（27 ℃、120 r/min）培養12 h。

1.3.2 赤霞珠葡萄酒釀酒工藝

新鮮赤霞珠葡萄經過破碎后加入60 mg/L的SO2（偏重亞硫酸鉀0.12 g/L），混合完全以避免氧化，隨后在10 ℃下冷浸漬24 h。將葡萄醪分成8個不同的接種處理（一式三份）：星形假絲酵母X11單菌發酵（接種量為約1×106CFU/mL）（編號為KF）、釀酒酵母CEC01單菌發酵（接種量約為1×106CFU/mL）（編號為NF）、釀酒酵母CEC01和星形假絲酵母X11共同接種（接種量為1×106CFU/mL，接種體積比為1∶1、1∶5和1∶10）（編號為G1：1、G1：5和G1：10）、星形假絲酵母X11和釀酒酵母CEC01順序接種（接種量為1×106CFU/mL，接種星形假絲酵母X11 48 h后接種釀酒酵母CEC01，接種體積比為1∶1、1∶5和1∶10）（編號為S1：1、S1：5和S1：10），在2 L發酵罐中進行微型發酵。以葡萄汁樣品（赤霞珠葡萄破碎后過濾得到）為對照（編號為CK），發酵溫度控制在25～27 ℃，每隔24 h進行壓帽處理（使葡萄果皮與葡萄果汁充分接觸）。當還原糖降至4 g/L以下時，加入50 mg/L的SO2（偏重亞硫酸鉀0.1 g/L）終止發酵，得到赤霞珠葡萄酒。

1.3.3 基本理化指標的測定

總酸含量（以酒石酸計）的測定參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酸堿滴定法；酒精度的測定參照國標GB/T 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》中的密度瓶法；揮發酸含量（以醋酸計）：采用水蒸氣蒸餾法；殘糖（以葡萄糖計）：采用斐林試劑熱滴定法。

1.3.4 揮發性化合物的測定

采用頂空固相微萃取氣相色譜與質譜聯用（HS-SPMEGC-MS）技術測定揮發性化合物。

揮發性化合物的提?。涸?5 mL頂空瓶中加入8 mL樣品、1 g氯化鈉，內標為2-辛醇（質量濃度為1 600 μg/L），放入微型磁力攪拌轉子，密封。在磁力加熱攪拌器上40 ℃平衡15 min，再萃取15 min，解吸5 min。

氣相色譜條件[16]：DB-WAX毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）。無分流進樣，進樣口溫度為250 ℃，載氣為超純氦氣（He）（純度99.99%），流速1 mL/min。升溫程序：以3 ℃/min從40 ℃升到130 ℃，再以4 ℃/min從130 ℃升到250 ℃，保持8 min。質譜條件：傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度250 ℃；電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV；質量掃描范圍25～350 m/z，間隔為0.2 s。

定性定量方法[17]：采用美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）質譜數據庫檢索，結合保留時間進行定性分析。定量分析：采用內標法進行半定量分析，揮發性化合物含量通過峰面積/內標面積×內標濃度計算。

1.3.5 數據處理

實驗數據采用Excel 2016進行數據統計、SPSS 18.0進行數據分析，多組分間比較使用One-way方差分析（analysis of variance，ANOVA）法、不同菌株發酵葡萄酒樣中香氣成分主成分分析（principal component analysis，PCA）；不同菌株發酵葡萄酒樣中揮發性化合物聚類分析（cluster analysis，CA），采用Origin 8.5進行作圖。每個樣品重復處理3次。

2 結果與分析

2.1 赤霞珠葡萄酒理化指標

發酵結束后各處理酒樣的基本理化指標見表1。由表1可知，所有不同菌株發酵葡萄酒樣品的理化指標符合國標要求，殘糖含量均低于4 g/L，酒精度約為13%vol。不同發酵方式的赤霞珠葡萄酒中揮發酸和總酸含量之間呈現一定差異，樣品KF與混合發酵葡萄酒樣品中揮發酸與總酸含量均高于樣品NF，其中樣品KF中總酸含量最高（6.41 g/L），樣品G1：5中揮發酸含量最高（0.46 g/L）。所有酒樣中總酸含量無顯著差異，而共同接種混合發酵葡萄酒樣品中揮發酸的含量均高于順序接種混合發酵。樣品S1：10的酒精度最高（14.09%vol），其次是樣品S1：5（13.76%vol）、樣品S1：1（13.69%vol），表明順序接種發酵方式的酒精發酵更徹底。

表1 不同菌株發酵赤霞珠葡萄酒樣品的基本理化指標Table 1 Basic physical and chemical indexes of Cabernet Sauvignon wine fermented by different strains

2.2 赤霞珠葡萄酒揮發性香氣成分

葡萄酒中的多種揮發性化合物對葡萄酒的香氣與風味有著重要的影響，本研究對不同菌株發酵葡萄酒樣品進行揮發性香氣成分分析，結果見表2。由表2可知，不同菌株發酵葡萄酒樣品中共檢出38種揮發性香氣化合物，其中包括8種醇類、8種脂肪酸、16種酯類、4種苯乙基類物質以及2種其他物質。葡萄汁樣品（CK）中共檢出29種揮發性香氣成分，與發酵處理的葡萄酒樣品中香氣物質組成種類和含量均存在顯著差異（P＜0.05）；然而，不同發酵方式香氣物質組成種類間沒有顯著差異（P＞0.05），但香氣物質含量間存在顯著差異（P＜0.05）。

醇類是葡萄酒中重要的香氣組成成分，與樣品NF相比，樣品KF和混合發酵葡萄酒樣品中醇類含量升高，其中樣品G1：10葡萄酒樣品中醇類含量最高（68 055.58 μg/L）。葡萄酒樣品中的醇類含量均高于葡萄汁樣品（CK），這說明釀酒酵母CEC01以及星形假絲酵母X11在葡萄酒發酵過程中能夠產生大量的醇類，對提升葡萄酒的感官品質有重要意義。兩組單菌發酵的葡萄酒樣品NF與KF中，樣品KF的醇類物質含量（16 160.11 μg/L）顯著高于樣品NF（9 399.25 μg/L）（P＜0.05），這表明了星形假絲酵母X11的代謝活動能給葡萄酒帶來更多的醇類[18]。與單菌發酵的兩組葡萄酒樣品對比，混合發酵葡萄酒樣品中醇類均高于單菌發酵，并且隨著星形假絲酵母X11的接種比例上升，葡萄酒樣品中醇類也呈現上升趨勢，這與非釀酒酵母的存活時間與存活數量有關[19]。

酯類是葡萄酒中香氣的主要貢獻者之一，可以賦予葡萄酒花香與果香[20]。葡萄酒樣品中的酯類含量在5 085.77～12 546.74 μg/L之間，顯著高于葡萄汁中的624.42 μg/L（P＜0.05）。單菌發酵的兩組葡萄酒樣品中，樣品KF的酯類含量（8209.05μg/L）顯著高于樣品NF組（5085.77μg/L）（P＜0.05）；在混合發酵葡萄酒樣品中，隨著星形假絲酵母X11的接種比例上升，酯類的含量顯著升高，這與ESCRIBANO R等[21]在non-Saccharomyces中的研究結果相似。乳酸丙酯能賦予葡萄酒奶酪味和果香味，在順序接種發酵過程中乳酸丙酯含量顯著增加，其中以樣品S1：5葡萄酒樣品中乳酸丙酯含量最高（7 079.96 μg/L），為樣品NF（2 810.51 μg/L）的2.52倍，這可能是在順序發酵過程中釀酒酵母CEC01與星形假絲酵母X11的互相作用促進了乳酸丙酯的生成[22]。

苯乙基類化合物能賦予赤霞珠葡萄酒花香與果香[23]，本研究中共檢測出4種苯乙基類化合物，在葡萄酒樣品中的總含量在1 078.91～13 483.72 μg/L之間，均顯著高于葡萄汁樣品（CK）中的總含量（108.83 μg/L）（P＜0.05），其中苯乙醇可以賦予葡萄酒玫瑰香愉悅氣味[24]。結果表明，發酵處理的葡萄酒樣品中苯乙醇含量均高于葡萄汁；在樣品KF與混合發酵葡萄酒樣品中苯乙醇的含量顯著高于樣品NF（P＜0.05），并且隨著星形假絲酵母X11的接種比例升高，葡萄酒樣品中苯乙醇含量有顯著增加。結果表明，星形假絲酵母X11具有高產苯乙醇的能力，這與ANDORRà I等[25]研究結果相似。

一般認為脂肪酸會給葡萄酒風味帶來負面影響，但這類物質能抑制葡萄酒中的芳香酯水解[26]。本研究中共檢測出8種脂肪酸，在順序接種的葡萄酒樣品中脂肪酸類物質總量（3 364.8 μg/L）低于共同接種的葡萄酒樣品（3 876.46 μg/L）。高濃度的脂肪酸會帶來葡萄酒風味帶來不良影響，但低濃度的脂肪酸可以促進相應酯類的合成。

表2不同菌株發酵赤霞珠葡萄酒香氣成分含量測定結果Table 2 Determination results of aroma components content in Cabernet Sauvignon wine fermented by different strains

不同菌株發酵葡萄酒樣品中揮發性化合物種類及相對含量見圖1。由圖1可知，高接種比例星形假絲酵母X11的赤霞珠葡萄酒樣品（G1：10與S1：10）中醇類的相對含量顯著高于其他赤霞珠葡萄酒樣品，但赤霞珠葡萄酒樣品中酯類的相對含量與星形假絲酵母X11接種比例呈現負相關，所有葡萄酒樣品中苯乙基類物質的相對含量無顯著差異，而酸類與其他物質的相對含量水平有限。然而，赤霞珠葡萄酒樣品與葡萄汁樣品（CK）中所有物質的相對含量都存在顯著差異。研究表明，不同發酵方式導致赤霞珠葡萄酒中各物質組分的相對含量不同，對赤霞珠葡萄酒的香氣品質有重要影響。

圖1 不同菌株發酵葡萄酒樣品中揮發性化合物的種類及相對含量Fig. 1 Types and relative contents of volatile compounds in wine samples fermented by different strains

2.3 不同菌株發酵葡萄酒揮發性香氣物質的主成分分析和聚類分析

本研究對39種揮發性香氣物質含量進行了主成分分析（PCA）和聚類分析（CA），結果分別見圖2和圖3。

圖2 不同菌株發酵葡萄酒樣品中揮發性化合物主成分分析結果Fig. 2 Principal component analysis results of volatile compounds in wine samples fermented by different strains

圖3 不同菌株發酵葡萄酒樣揮發性化合物聚類分析結果Fig. 3 Cluster analysis results of volatile compounds in wine samples fermented by different strains

由圖2可知，主成分1（PC1）的方差貢獻率為71.2%，主成分2（PC2）的方差貢獻率為13.2%，累計方差貢獻率達到了84.4%，基本可以解釋原始變量的大部分變異信息。兩種單菌發酵方式之間無顯著差異，但與CK的差異較大。根據不同的出發菌株，樣品NF、KF位于PC1的負半軸，樣品S1：10、S1：5、G1：10、G1：5位于PC1的正半軸；根據混合發酵的不同接種方式，順序接種方式的葡萄酒樣品均位于PC2的負半軸，共同接種的樣品G1：10位于PC2的正半軸；根據混合發酵中不同的接種比例，樣品S1：10、G1：10、S1：5、G1：5位于PC1的正半軸，樣品S1：1、G1：1位于PC1的負半軸，說明不同接種方式和釀酒酵母CEC01與星形假絲酵母X11的不同接種比例對赤霞珠葡萄酒的揮發性香氣化合物有重要影響。

由圖3可知，混合發酵樣品S1：10和G1：10中大部分香氣化合物含量較高，其中樣品S1：10中乙酸乙酯、己酸乙酯、癸烯酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇含量較高；樣品G1：10中苯甲醇、甲酸正己酯、苯乙酸乙酯含量較高。不同發酵處理方式間揮發性香氣化合物含量差異較大，混合發酵葡萄酒樣品中大部分揮發性香氣化合物含量高于釀酒酵母CEC01單菌發酵葡萄酒樣品，樣品G1：10與S1：10樣品中香氣化合物含量顯著高于其他赤霞珠葡萄酒樣品（P＜0.05），且具有更多的特征性香氣化合物。結果表明，高接種比例星形假絲酵母X11的混合發酵方式對赤霞珠葡萄酒的香氣產生積極影響。

2.4 星形假絲酵母X11對葡萄酒風味的影響

葡萄酒中揮發性化合物的種類與含量與葡萄酒香氣品質有密切的聯系[27]。本研究對22種（其中包括15種酯類、5種醇類、5種脂肪酸類、2種苯乙基類化合物以及1種其他物質，OAV＞0.1）揮發性香氣化合物進行了氣味活性值（odor activity value，OAV）（OAV=揮發性香氣化合物濃度/揮發性香氣化合物閾值[28]）分析結果見表3。

表3 不同菌株發酵對赤霞珠葡萄酒氣味活性值的影響Table 3 Effect of different strains fermentation on the odor activity value of Cabernet Sauvignon wine

當OAV＞1時，認為該化合物為葡萄酒的特征性香氣化合物；OAV＞0.1時，揮發性化合物可能通過與其他化合物的協同、抑制、組合等作用對葡萄酒的香氣品質產生影響[16]。由表3可知，OAV＞1的揮發性化合物在樣品CK、NF、KF中分別檢測到3種、6種、8種，混合發酵葡萄酒樣品G1：1中檢測到的種類最少為7種，而樣品S1：10、G1：10中檢測到種類最多為16種，高接種比例星形假絲酵母X11的混合發酵方式能提高赤霞珠葡萄酒的香氣復雜性。

在檢出的22種揮發性化合物中，己酸乙酯、異戊醇、己酸乙酯、癸烯酸乙酯、乙酸乙酯和苯乙醇在所有混合發酵葡萄酒和KF組樣品中OAV均＞1，而乳酸丙酯在樣品NF中OAV為0.8，未發酵的葡萄汁樣品中只有己酸乙酯的OAV＞1。苯乙醇的OAV隨著星形假絲酵母X11的接種比例上升而增加，這表明了星形假絲酵母X11可以給赤霞珠葡萄酒帶來濃郁的玫瑰香氣。

選取酒樣中OAV＞0.1的香氣物質，根據這些物質的香氣類型繪制赤霞珠葡萄酒的香氣雷達圖見圖4。由圖4可知，所有試驗酒樣香氣以玫瑰香味為主，其次為奶酪味、青草味、果香味和脂肪味。結果表明，不同發酵方式的葡萄酒中青草味和脂肪味無顯著差異；其中混合發酵S1：1中具有最濃郁的奶酪味，混合發酵樣品S1：10中具有最濃郁果香味和玫瑰香味；混合發酵葡萄酒和星形假絲酵母X11單菌發酵葡萄酒中玫瑰香味均比釀酒酵母CEC01單菌發酵葡萄酒強烈，并且相同接種比例的順序接種混合發酵葡萄酒中玫瑰香味均比共同接種混合發酵葡萄酒強烈。綜上可知，星形假絲酵母X11能夠增強赤霞珠葡萄酒的玫瑰香味特征，與高接種比例星形假絲酵母X11的混合發酵顯著提高了赤霞珠葡萄酒樣品中苯乙醇含量有關，并且混合發酵中順序接種方式優于共同接種方式，這與BENITO S等[33]研究結果相似。

圖4 不同菌種發酵葡萄酒樣品揮發性香氣成分的風味雷達圖Fig. 4 Flavor radar chart of volatile aroma components in wine samples fermented by different strains

3 結論

目前葡萄酒的釀造方式大部分是采用釀酒酵母進行純種發酵，造成了葡萄酒風味的單一化。本研究采用HSSPME-GC-MS技術測定釀酒酵母CEC01和星形假絲酵母X11單菌發酵、共同發酵和順序發酵葡萄酒中的揮發性香氣化合物，探討星形假絲酵母X11強化赤霞珠葡萄酒玫瑰香氣的條件。星形假絲酵母X11的單菌發酵和混合發酵葡萄酒中苯乙醇含量顯著高于釀酒酵母CEC01單菌發酵（P＜0.05）。隨著星形假絲酵母X11接種比例的增加，苯乙醇的含量顯著增加（P＜0.05）。因此，本研究認為星形假絲酵母X11具有提升葡萄酒玫瑰香氣的應用潛力；結果表明，釀酒酵母CEC01與星形假絲酵母X11 以1：10接種比例的順序接種發酵方式能夠有效改善葡萄酒風味單一化的問題。