醬香型白酒機械化釀造不同輪次堆積發酵酒醅真菌群落結構多樣性研究

張瀚之，席德州，，王 歡，黃永光，*，尤小龍，胡 峰，邱樹毅

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司，貴州 習水 564600）

醬香型白酒是中國三大典型香型之一，在中國食品產業發展中占有非常重要的地位。2020年，遵義規模以上企業白酒產量達到24.5萬kL，工業增加值達1 129億元，占全市工業增加值的77%[1]，對貴州的經濟建設貢獻極大，是名副其實的傳統經濟支柱產業。而醬香型白酒又因其“四高兩長”的獨特的釀造工藝（即高溫制曲、高溫堆積、高溫發酵、高溫流酒和生產周期長、貯存期長），擁有獨特的風格特征，始終占據著高端白酒的市場規模。其中，高溫堆積是醬香型白酒特有的釀造工藝，大量釀造環境中的微生物在此過程中富集，為窖池發酵提供了大量的微生物儲備、酶類資源和香味物質及其前體物質[2]，保證醬香型白酒的產量與品質。因此，醬香型白酒的生產領域一直存在著“無堆積，不產酒”的說法[3]。堆積發酵采用開放式的固態發酵模式，微生物是其過程的主導者。其中，真菌在此過程中提供了源源不斷的酶類資源，為糖化和發酵提供動力，特別是酵母菌，其數量和種類在堆積前后有大幅增加[4]，這在很大程度上彌補了高溫大曲中酵母數量少而導致的發酵力不足的缺陷，保證了醬香型白酒的正常生產。因此，堆積發酵中真菌的菌群結構一直以來是眾多學者研究的重點[5-7]。黃永光等[8]通過分離培養基分析堆積酒醅不同層面的酵母群落結構，發現堆積上層的酵母數量要多于中下層，堆積中心的酵母數量在發酵初期多于表層，而發酵后期則因氧含量等參數變化導致外層酵母多于中心點，該結果初步揭示了堆積過程中的酵母群落結構的變化。然而，通過可培養只能認識發酵酒醅中1%～10%的微生物，遠遠不能準確反映發酵體系中的微生物群落結構變化。因此，必須應用現代研究技術分析釀造微生物體系，而高通量測序技術近年來被廣泛應用于解析微生物群落結構變化[9]。

在醬香型白酒堆積發酵過程中，黃蘊利等[10]采用高通量測序方法研究了醬香型白酒第二輪次發酵酒醅中的微生物群落結構，發現堆積酒醅中的優勢真菌屬主要為嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、假絲酵母屬（Candida）和曲霉屬（Aspergillus）；郭敏等[11]運用高通量測序方法研究了醬香型白酒第三輪次和第七輪次的發酵酒醅微生物群落結構，三輪次的優勢真菌屬為嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和嗜熱真菌屬（Thermomyces），七輪次酒醅的優勢細菌屬為隱球菌屬（Cryptococcus），且兩個輪次酒醅的微生態多樣性存在差異。上述研究初步揭示了醬香型白酒堆積發酵過程中的微生物菌群結構，但主要集中在單一的輪次或者傳統的釀造過程。而醬香型白酒的堆積發酵工藝因一直沿襲傳統的人工上堆模式，勞動強度大，可控性較差，容易受環境因素和人為操作差異的影響。而其他香型，如濃香型[15]、清香型[16]白酒的機械化表明，機械化釀造不僅降低了勞動強度，還保證了釀造質量的可控性。因此，在機械化發展的大趨勢下，醬香型白酒需要改變生產方式、降低生產成本、提高產品品質、發展安全高產的機械化釀造模式，實現跨越式發展。其中，機械化堆積發酵過程中細菌的微生物菌群結構本課題組已經進行了詳細的報道[12]。

基于此，本研究以醬香型白酒釀造機械化釀造堆積發酵過程中的發酵酒醅為樣品，利用高通量測序技術對醬香型白酒機械化堆積發酵過程中真菌菌群結構特征及其與發酵環境因子的內在機制進行了系統研究，全面的解析醬香型白酒機械化釀造時，堆積發酵過程的真菌結構和主導性真菌菌群結構的變化規律，進一步為研究其發酵機理提供科學依據，同時也為醬香型白酒機械化釀造提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：采集于貴州XJ公司醬香型白酒機械化制酒車間1～7輪次堆積發酵的酒醅，標記為1DJ～7DJ；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒：美國OmegaBio-Tek公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增引物：北京全式金生物技術有限公司；凝膠提取試劑盒：美國Axygen Biosciences公司。

1.2 儀器與設備

HeraeusMultifugeX1R臺式高速冷凍離心機：德國Sigma公司；E002092超凈工作臺：蘇州市金凈凈化設備科技有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；HQ-60-II渦旋振蕩器；ABI Gene AmpR9700 PCR儀：美國伯樂公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像系統：上海培清科技有限公司；Zealway G154DW高壓蒸汽滅菌鍋：美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

樣品的采集參考王歡等[12]方法。采集周期為1 d，從收堆后開始采集，直至堆積發酵堆的表層的酒醅溫度達50 ℃時結束。由于不同輪次酒醅堆積時間不同，最終1～7輪次酒醅分別堆積3 d、6 d、6 d、4 d、3 d、2 d、2 d。以一輪次為例說明取樣情況，如圖1所示，采取同一天的A點（堆積發酵堆上層中點），B、C點（中層堆中心和堆表層部位的內表層），D、E點（下層堆中心和堆表層部位的內表層）后，立即用無菌袋包裝，并將采集的所有樣品均勻混合，-20 ℃保存。再將上述同一輪次酒醅的采集樣品等份量混合均為1個樣品（一天所采5個單樣品等量混合均勻代表一天采集酒醅的樣品，再將每一輪次酒醅每一天采集的樣品再次等量混合均勻作為該輪次堆積樣品），最終，1～7輪次酒醅共獲得7個最終混合樣品（本研究1～7輪次酒醅總共取樣26 d，編號為1DJ～7DJ，每輪次取5個點，共采集酒醅樣品130個小樣）。

圖1 堆積酒醅取樣示意圖Fig. 1 Schematic diagram of sampling of stacked fermented grains

1.3.2 DNA提取

DNA提取前處理的方法與文獻[12]一致。具體的酒醅總DNA提取步驟參考土壤DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.Soil DNA Kit）操作說明書。

1.3.3 聚合酶鏈式反應擴增及Illumina Hi Seq高通量測序

采用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGAGAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）PCR擴增ITS區基因序列。PCR擴增體系（20 μL）：0.8 μL正向引物，0.8 μL反向引物，2 μL 10×Buffer，2 μL脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTP），0.2 μLrTaqDNA聚合酶，2 μL模板DNA和12.2 μL無菌雙蒸水（ddH2O）。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共循環35次；72 ℃再延伸10 min。隨后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。隨后將DNA送至上海美吉使用Illumina HiSeq平臺（中國上海美吉生物技術有限公司）進行高通量測序。

1.3.4 理化指標的測定

水分測定采用烘干法，采用酸堿滴定法測定酸度，采用斐林試劑法測定淀粉、還原糖。具體參照文獻[12]。

1.3.5 數據處理

基于Illumina Miseq測序平臺中的R語言繪制群落組成圖、Heatmap圖、冗余分析圖，柱狀圖利用Origin 9.0軟件進行繪制。

2 結果與分析

2.1 醬香型白酒不同輪次酒醅理化指標分析結果

醬香型白酒的理化指標是鑒定不同輪次酒醅是否發酵成熟的標準，反映著醬酒的品質高低，而理化指標是主要受生產工藝和發酵時間的影響，不同輪次的工藝參數不一致，因此對不同輪次的堆積酒醅理化指標進行了測定，深入解析理化指標引起的群落多樣性的變化，結果見圖2。

圖2 酒醅樣品理化指標的變化Fig. 2 Change of physicochemical indexes of Jiupei samples

如圖2A所示，糟醅水分含量隨著輪次的增加顯著地增加（P＜0.05），在第6輪次時達到最大值，而后保持平衡。酸度主要是產酸菌進行有機酸的代謝、生成其他酸性物質進而營造酸性環境。其在防止雜菌污染的同時，可將有機酸類物質作為主要風味物質，且為酯類物質的生成提供豐富的前體[13]。張健等[14]發現，總酸與白酒香氣強度和協調性呈強正相關。如圖2B所示，與水分含量相似，醬香型白酒堆積發酵過程中酸度先增加后降低，在第5輪次達到最高值，第6輪次顯著降低而后保持穩定。還原糖經淀粉酶、糖化酶等分解淀粉而生成，是微生物發酵的主要能量來源，醬香型白酒釀造是邊糖化邊發酵的過程，酒醅中還原糖的含量在一定程度上可以反應酒醅發酵速度以及發酵情況，是衡量發酵質量的重要指標之一。如圖2C所示，2～5輪次酒醅的還原糖含量較高，且彼此沒有顯著性差異（P＞0.05），而3、4輪次與1、6、7輪次存在顯著性差異，這也與實際生產中的發酵質量相吻合。淀粉是酒精及其他代謝產物的物質基礎，酒醅的淀粉含量能有效反映出原料中淀粉是否利用充分及酒醅是否需要繼續發酵，如圖2D所示，隨著輪次的增加，淀粉含量顯著降低（P＜0.05），這是因為隨著發酵輪次的增加，淀粉不斷的被分解成小分子物質供微生物利用，這也與生產實踐相吻合。

2.2 真菌群落組成分析

2.2.1 在門水平上的分布

基于Illumina Miseq測序在機械化釀造7個輪次酒醅中共檢出真菌4個門，102個屬，185個OTU，酒醅樣品中真菌群落結構在門水平上的分布結果見圖3。

圖3 酒醅樣品中真菌群落結構在門水平上的分布Fig. 3 Fungal community structure of Jiupei samples at phylum level

如圖3所示，子囊菌門（Ascomycota）在不同輪次酒醅堆積發酵過程中占絕對優勢地位（相對豐度占96.57%～99.99%），且隨著輪次的增加而減少。此外，研究表明Ascomycota是醬香型[15]、清香型[16]、濃香型[17]釀造酒醅的主要真菌，說明該菌門是中國白酒發酵過程中的關鍵真菌微生物種群。擔子菌門（Basidiomycota）在前三輪次酒醅基本未檢出，從第四輪次開始含量增加。

2.2.2 在屬水平上的分布

酒醅樣品中真菌群落結構在屬水平上的分布見圖4。由圖4可知，從機械化釀造1～7輪次堆積發酵過程共檢出真菌102個真菌屬，而成品曲中檢出60個真菌屬[18]，說明在堆積發酵過程富集了42個真菌屬。

圖4 酒醅樣品中真菌群落結構在屬水平上的分布Fig. 4 Fungal community structure of Jiupei samples at genus level

1～7輪次酒醅中分別檢出23、34、62、35、40、35和50個屬，說明7個輪次堆積發酵酒醅樣本中的主要真菌群落組成存在較大的差異。其中，一輪次堆積發酵酒醅中的優勢真菌屬（＞1%）有2個，分別為有孢圓酵母屬（Torulaspora）和威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）；二輪次有6個，包括嗜熱真菌屬（Thermomyces）、假絲酵母屬（Candida）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）等，三輪次有8個，包括有孢圓酵母屬（Torulaspora）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）等；四輪次有9個，包含嗜熱真菌屬（Thermomyces）、曲霉屬（Aspergillus）等；五輪次有9個，為嗜熱真菌屬（Thermomyces）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）等；六輪次有10個，分別為嗜熱真菌屬（Thermomyces）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）等；七輪次有8個，包括絲衣霉屬（Byssochlamys）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、曲霉屬（Aspergillus）等。

各個輪次堆積酒醅中沒有共有的優勢菌屬，但嗜熱真菌屬（Thermomyces）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）、絲衣霉屬（Byssochlamys）、假絲酵母屬（Candida）和威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）的相對豐度較高（＞10%）。且嗜熱真菌屬（Thermomyces）是醬香型白酒大曲[19]中的優勢真菌，是白酒釀造過程中重要酶類的來源，可促進微生物的生長繁殖以及產酒生香[4]。嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）能夠產生熱穩定的水解酶，降解原料中的淀粉或纖維素，是白酒釀造過程不可或缺的重要菌屬[20]。曲霉屬（Aspergillus）為醬香型白酒酒醅、醬香大曲[21]的優勢菌屬，能產生多種酶類，可調控大曲和酒醅的糖化力、酯化力、液化力，是公認的功能菌。同時其可通過代謝有機酸、脂肪酸，促成芳香酯類物質的生成，以提升和改善酒體風味[22]。孢圓酵母屬（Torulaspora）能產生大量的高級醇、酯類物質、酸類物質等，可明顯提高酒中乙基酯類的含量，增加酒體的果香味[23]，其在醬香型白酒[24]中均檢測出。絲衣霉屬（Byssochlamys）隨著發酵輪次的進行逐漸增多（0.34%～69.03%），產生該現象的原因可能是發酵酒醅的酸度變化為該菌的生長提供了適宜的條件[25]。Byssochlamys能產生耐熱的子囊孢子[26]，該菌屬在醬香型白酒釀造酒醅中[10]和大曲中均可檢出[27]。假絲酵母屬（Candida）在機械化釀造堆積的二輪次中豐度較高，在第五輪次中則幾乎未檢測出，溫度的變化是導致該現象的主要原因[28]，Candida是醬香型白酒堆積和窖池發酵酒醅優勢真菌屬[10]，對提升酒體品質具有重要作用。威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）只在一輪次的堆積酒醅中豐度較高，是重要的生香酵母屬，耐高酸度[29]且產酯能力強[30]，主要來源于大曲的添加。綜合其豐度和功能，上述真菌屬被認為是醬香型白酒機械化堆積過程中的重要真菌屬，說明在醬香型白酒堆積發酵過程存在穩定的微生物結構演替，從而為酒醅的發酵提供內在的動力。

由于各輪次發酵酒醅的不斷蒸煮糊化以及發酵環境的改變，使得7個輪次酒醅中的微生物群落結構存在一定的差異。其中一、二輪次堆積酒醅樣品中的真菌種類相對較少，而從三輪次開始，真菌群落逐漸增多；另外，1～3個輪次堆積酒醅中的真菌主要以酵母菌為主，4～7輪次中則以霉菌為主，產生這種現象的原因可能是酒醅經過機械化的輸送和堆積，在很大程度上會增大其水分含量和糟醅黏性，使得發酵后期的酵母生長受到抑制。七個輪次機械化堆積的發酵時間以及發酵環境不同，導致其微生物結構組成不同，這也是形成不同酒體風格的重要原因之一。

2.3 環境因子對酒醅真菌群落組成結構的影響

微生物的生命活動離不開環境因子的調控，因而環境因子對于醬香型白酒機械化釀造過程中的真菌菌群結構組成有著密切的關系，環境因子對酒醅真菌群落結構的影響見圖5。

圖5 環境因子對酒醅樣品真菌群落結構的影響Fig. 5 Effects of environmental factors on fungal communities of Jiupei samples

由圖5可知，水分、酸度、還原糖、淀粉含量對微生物群落結構有著重要的影響，其中淀粉含量與酸度和水分負相關（環境因子箭頭間的夾角為鈍角），淀粉和還原糖之間以及還原糖與水分之間關聯性不強（環境因子箭頭間的夾角接近直角），而水分和酸度含量、還原糖和酸度呈現正相關（環境因子箭頭間的夾角為銳角），且微生物受淀粉含量、水分和酸度的影響較大（投影點距離原點的距離較遠）。其中，不同輪次的真菌菌群結構受淀粉含量影響較大，隨著輪次的增加，與淀粉含量的相關性從正相關走向負相關，這主要是因為上一節中說明在不同輪次中存在穩定的霉菌結構，其可直接利用淀粉，分解淀粉為小分子物質為其他微生物提供養料，隨著發酵輪次的增加，酒醅中的淀粉已經消耗殆盡，發酵進入尾聲，沒有更多的發酵底物供給微生物生長。1～3輪次酒醅發酵的微生物結構與水分負相關，而4～7輪次酒醅與水分正相關。這是因為不同輪次酒醅發酵過程的環境溫度在逐步增加，且隨著輪次的增加，酒醅不斷的蒸煮，其保水能力變弱。1～3輪次酒醅發酵過程微生物菌群結構與酸度呈負相關，而4～7輪次酒醅與酸度呈正相關，隨著發酵的進行，產酸微生物代謝酸類化合物使得酸度不斷的增加。一輪次和七輪次酒醅的微生菌群結構與還原糖含量呈負相關，其他輪次對于微生物的結構的影響較小。生產實踐表明，一輪次和七輪次的酒質不好這也許與還原糖的含量有關。

2.4 環境因子與微生物關聯性分析

為進一步探究環境因子對哪些菌屬的影響較大，進而方便控制參數來保證發酵的正常運行。將微生物菌屬與環境因子進行關聯性分析，真菌群落與環境因子的相關性熱圖見圖6。

由圖6可知，大部分菌屬與水分、酸度及還原糖呈正相關，而與淀粉含量呈負相關。其中，紅曲霉屬（Monascus）、Rasamsonia、Trichosporon、Penicillium、Microascus與水分和酸度呈顯著或極顯著正相關（P＜0.01），而與淀粉含量呈顯著負相關（P＜0.05）。紅曲霉屬（Monascus）是醬香型白酒釀造中主要霉菌，具有一定的糖化發酵力和較強的酯化力，在發酵過程中能產生多種酶類，如蛋白酶、淀粉酶、糖化酶等，對提高出酒率、增加酯類化合物的生成具有積極影響。同時，還可產生多種對人體有益的次級代謝產物，如紅曲色素、γ-氨基丁酸等[31]。Rasamsonia在醬香型白酒大曲中檢出，該菌屬能耐高溫，有利于淀粉的分解[32]。Trichosporon是醬香型白酒釀造過程中公認的產多元醇的功能酵母[33]，Penicillium在醬香型白酒在傳統釀造過程中均能檢測到，其產生的酶種類較豐富且齊全，主要是蛋白酶、纖維素酶、酯化酶，此外還其代謝物大多具有抑菌作用[34]。Microascus在醬香型白酒大曲中檢出[35]。而豐度較大的菌屬，如Thermomyces、Thermoascus、Aspergillus、Candida和Wickerhamomyces，其受環境因子的影響較小。而Torulaspora與酸度呈負相關，Byssochlamys與淀粉呈負相關。上述結果表明，在機械化釀造堆積發酵過程中，重要真菌屬和優勢菌屬受環境因子的調控不大，從而保證發酵的底物充足，而不同輪次又存在著與水分、淀粉含量和酸度緊密相關的菌屬，其隨著環境的變化而變化，從而動態的調控著釀造發酵的正常進行。

圖6 真菌群落與環境因子的相關性熱圖Fig. 6 Heatmap of correlation between fungal communities and environmental factors

3結論

本研究利用高通量測序及數理分析方法系統性的研究醬香型白酒機械化釀造不同輪次堆積發酵酒醅中的真菌菌群結構特征，七個輪次酒醅中共檢出真菌4個門，102個屬，185個OTU。Thermomyces、Thermoascus、Aspergillus、Torulaspora、Byssochlamys、Candida和Wickerhamomyces被認為是醬香型白酒機械化堆積過程中的重要真菌屬。醬香型白酒機械化釀造過程中的真菌微生物受淀粉含量、水分和酸度的影響較大。其中隨著輪次的增加，真菌的菌群結構與淀粉含量的相關性從正相關變為負相關，1～3輪次發酵酒醅的微生物結構與水分和酸度負相關，而4～7輪次發酵酒醅與水分和酸度正相關。一輪次和七輪次酒醅的微生菌群結構與還原糖含量呈負相關，其他輪次對于微生物的結構的影響較小。在機械化釀造堆積發酵過程中，重要的菌屬受環境因子的調控不大，但不同輪次存在著與水分、淀粉含量和酸度緊密相關的菌屬，保證動態的調控釀造發酵過程。本研究通過高通量測序技術系統解析了機械化釀造堆積酒醅中的主要真菌群落結構變化，揭示了機械化堆積在真菌群落結構組成，為全面實現醬香型白酒機械化釀造提供了理論依據。