添加亞硒酸鈉對發酵甘藍的影響

董紅兵，王 菁，龔元元，朱于鵬，3，汪 超，祁勇剛，李蕙蕙*

（1.武漢商學院食品科技學院，湖北 武漢 430056；2.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068；3.恩施硒圣植物科技有限公司，湖北 恩施 445000）

甘藍（Brassica oleraceavar.capitata）又名洋白菜、卷心菜，由于其具有產量高，肉質厚而硬、致密堅實的特點，適宜發酵制備酸菜調味品或者泡菜。發酵蔬菜中包括大量的微生物，如細菌、酵母、霉菌等，燕平梅等[1]基于宏基因組學技術研究了發酵甘藍泡菜老湯中的微生物群落結構，發現泡菜老湯中含有大量的乳酸菌，發酵后期以耐酸的乳酸菌為主；張銳等[2]研究榨菜腌漬過程中，發酵初期是明串珠菌，中后期是植物乳桿菌、短乳桿菌；張魯冀等[3]研究自然發酵的東北酸菜發現，酸菜中有植物乳桿菌、短乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌；汪冬冬等[4-5]研究發酵甘藍中細菌變化發現，發酵甘藍中有植物乳桿菌、芽孢桿菌、葡萄球菌等細菌；曾駿等[6-7]鑒定了發酵蔬菜中酵母菌有異常漢遜酵母、德式酵母、螺絲酵母、球擬酵母、假絲酵母等；乳酸菌制造酸性環境利于酵母菌的生長，而酵母菌乙醇代謝產物也有利于乳酸菌的進一步生長，二者具有協同作用[8-9]。王海平等[10]研究四種腌制方式對甘藍品質的影響，發現純種濕法可提高發酵速度和乳酸菌菌落數，使亞硝峰峰值快速降低至穩定值，感官評分也最高；王芮東等[11]研究發現，純種發酵甘藍總酸最高、感官最佳；劉程惠等[12]發現糖、香辛料和水果的添加可促進甘藍泡菜總酸的增加，糖對亞硝酸鹽有促進作用，而香辛料和水果的添加可抑制其產生；張向美玲等[13]研究發現，菊花溶液含量為1%時，甘藍發酵成熟時乳酸菌最高，霉菌較少；汪冬冬等[14]研究發現，甘藍發酵溫度范圍為10～35 ℃，提高溫度利于產酸，縮短發酵時間，溫度與乳酸、乙酸含量呈正相關，與檸檬酸、蘋果酸和游離氨基酸成反比，低溫有利于防止酸敗。發酵甘藍中亞硝酸鹽的研究多集中在發酵方式、菌種篩選、起始pH值、影響因子添加、變化規律和累積機理研究等[15-18]。

硒元素具有抗氧化和抗癌作用，可提高免疫力和預防心血管疾病[19]。微生物可以富集和轉化無機硒為有機硒，已成為硒生物轉化的研究熱點。本研究選用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和異常漢遜酵母（Hansenula anomala）為發酵菌株，研究添加亞硒酸鈉對接種發酵甘藍的影響，旨在為提升發酵甘藍品質提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平頭甘藍：由湖北聚匯農業開發有限公司提供。

蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑），氯化鈉、無水乙醇、乙酸乙酯、氫氧化鈉、乙酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

植物乳桿菌、異常漢遜酵母：實驗室保藏菌種，篩選自湖北聚匯農業開發有限公司大白菜腌漬池。

1.2 儀器與設備

F-4700熒光分光光度計：日立科學儀器（北京）有限公司；PHSJ-6L型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；PC-420磁力恒溫攪拌器：美國Corning公司；QDWZⅠ3000-7D濕法粉碎機：無錫輕大食品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵甘藍的制備

參考屠夢婷[20]的方法并做改良，將發酵壇清洗干凈，用體積分數75%的酒精擦拭滅菌，將洗凈瀝干切分好的甘藍放入發酵壇中，加4.5%的白砂糖和4.0%食鹽水浸漬，同時加入亞硒酸鈉（濃度分別設置為0、15 μmol/L、30 μmol/L、45 μmol/L、60 μmol/L、75 μmol/L、90 μmol/L），攪拌均勻，每罐分別加入體積分數3.0%植物乳桿菌種子液（1.65×109CFU/mL）和體積分數2.0%異常漢遜酵母菌種子液（1.13×109CFU/mL），密封28 ℃發酵6 d，試驗重復3次。

1.3.2 發酵甘藍感官評價標準

發酵甘藍的感官評價標準見表1。

表1 發酵甘藍的感官評價標準Table 1 Sensory evaluation standards of the fermented cabbage

續表

1.3.3 乳酸菌和酵母菌的測定

按照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》對發酵甘藍中乳酸菌進行測定；酵母菌按照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》對發酵甘藍中酵母菌進行測定。

1.3.4 pH、總酸、總酯、硝酸鹽和亞硝酸鹽的測定

pH測定采用pH計測定；總酸（以乳酸計）按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中酸堿滴定法測定；總酯（以乙酸乙酯計）參考GB/T 19777—2013《地理標志山西老陳醋》測定；硝酸鹽和亞硝酸鹽按照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》測定。

1.3.5 總硒和有機硒的測定

總硒和有機硒按照DBS 42/002—2014《富有機硒食品硒含量要求》中方法測定。

1.3.6 數據分析運用處理與Origin 9.5和SPSS 20.0軟件對實驗數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 不同亞硒酸鈉添加量對甘藍發酵中乳酸菌和酵母菌數的影響

將從腌漬白菜中篩選的乳酸菌和酵母菌接種于甘藍中發酵，研究亞硒酸鈉的添加量對發酵過程中乳酸菌和酵母菌的影響，結果分別見表2和表3。由表2可知，隨著發酵時間的延長，發酵1 d后乳酸菌由106數量級迅速增長至108，而后緩慢增大趨于穩定；添加了亞硒酸鈉的實驗組，在相同濃度下，發酵1 d后，乳酸菌菌落數顯著增大（P＜0.05），且發酵4 d后，菌落數達到峰值后保持穩定；相同發酵時間條件下，隨著亞硒酸鈉濃度增加乳酸菌菌落數也持續增大，但增速逐漸放緩，在亞硒酸鈉濃度為60 μmol/L時，其乳酸菌菌落數增速效果較好，為最適宜添加濃度。

表2 不同亞硒酸鈉添加量對甘藍發酵中乳酸菌數的影響Table 2 Effect of different sodium selenite addition on number of lactic acid bacteria during cabbage fermentation

由表3可知，亞硒酸鈉對酵母菌的影響與乳酸菌一致，添加了亞硒酸鈉，隨著發酵時間的延長，酵母菌菌落數顯著增加（P＜0.05），在發酵4 d后趨于穩定；相同發酵時間條件下隨著亞硒酸鈉添加量的增加，酵母菌菌落數逐漸增加，且在亞硒酸鈉濃度為60 μmol/L后，酵母菌增速放緩，因此選擇亞硒酸鈉濃度為60 μmol/L作為后續研究的最佳值。發酵液中的亞硒酸鈉可能會被乳酸菌和酵母菌轉化利用，進而提高自身代謝速率和抵抗外界環境的能力，進而促進其快速增殖。

表3 不同亞硒酸鈉添加量對甘藍發酵中酵母菌數的影響Table 3 Effect of different sodium selenite addition on number of yeast during cabbage fermentation

2.2 亞硒酸鈉對發酵甘藍pH和總酸含量的影響

在甘藍發酵前添加亞硒酸鈉，使發酵液濃度為60μmol/L，接種體積分數3.0%植物乳桿菌種子液（1.71×109CFU/mL）和體積分數2.0%異常漢遜酵母菌種子液（1.08×109CFU/mL），發酵6 d，測定發酵液pH和總酸，結果見圖1。

圖1 亞硒酸鈉對發酵甘藍pH和總酸含量的影響Fig. 1 Effect of sodium selenite on pH and total acid contents of fermented cabbage

從圖1可知，隨著發酵時間延長，甘藍發酵液總酸穩定升高，相比對照組，發酵1 d后，實驗組總酸增速更快、含量更高，達到0.943 g/100 g。實驗組和對照組的pH隨發酵時間的變化趨勢一致，接種發酵后，pH值顯著降低，發酵2 d后緩慢減低，但實驗組pH降低的更快，發酵6 d后pH值由初始的5.91降低為3.21，使發酵液在更短的發酵時間內pH值更低，這可能會縮短甘藍發酵時間。添加了亞硒酸鈉，促進乳酸菌和酵母菌快速增殖，會代謝產生更多的乳酸、乙酸，造成總酸含量更高，同時，使甘藍發酵液具有更低的pH值。

2.3 亞硒酸鈉對發酵甘藍總酯的影響

亞硒酸鈉對發酵甘藍總酯含量的影響見圖2。由圖2可知，實驗組和對照組在發酵前2天總酯增長緩慢，2 d后明顯增大，發酵6 d后分別增至3.493 g/kg和2.502 g/kg，可見添加亞硒酸鈉在發酵第6天時使發酵甘藍總酯含量提高39.61%。亞硒酸鈉促進植物乳桿菌和異常漢遜酵母的快速增殖，提高發酵液總酸含量及其本身耐酸性，代謝更多更高含量的酸和醇類，進而提高總酯的含量。

圖2 亞硒酸鈉對發酵甘藍總酯含量的影響Fig. 2 Effect of sodium selenite on total ester contents of fermented cabbage

2.4 亞硒酸鈉對發酵甘藍總硒和有機硒含量的影響

硒是機體不可或缺的微量元素，有機硒被認為更有利于機體吸收，其存在形式也多種多樣，可由機體代謝產生，乳酸菌和酵母菌均具有較強的富硒和有機硒轉化能力。添加60 μmol/L亞硒酸鈉對發酵甘藍中總硒和有機硒的影響見圖3。由圖3可知，發酵1 d時，隨著植物乳桿菌和異常漢遜酵母菌的快速增殖，亞硒酸鈉大量轉化為有機硒，而在發酵2 d后又顯著增加，原因可能是此時發酵甘藍中總酸過高，菌株為了抵抗酸性環境而利用無機硒轉化為有機硒合成功能物質以提高自身抗逆性，其他發酵時間段有機硒增加緩慢，發酵6 d后，有機硒為3.80 mg/kg，轉化率達80.68%。

圖3 亞硒酸鈉對發酵甘藍中總硒和有機硒含量的影響Fig. 3 Effect of sodium selenite on total selenium and organic selenium contents of fermented cabbage

2.5 亞硒酸鈉對發酵甘藍中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的影響

甘藍中含有硝酸鹽，尤其是化肥過量的使用，導致甘藍的硝酸鹽含量更高[21-22]，因此在腌制過程中甘藍會生成更多的亞硝酸鹽，相對自然發酵，接種發酵可以使亞硝酸鹽含量顯著降低[26]。亞硒酸鈉對發酵甘藍中硝酸鹽和亞硝酸鹽的影響見圖4。

圖4 亞硒酸鈉對發酵甘藍中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的影響Fig. 4 Effect of sodium selenite on nitrate and nitrite contents of fermented cabbage

由圖4可知，隨著發酵進行，甘藍中的硝酸鹽持續顯著下降（P＜0.05），直至降低到0.093 g/kg以下，而添加了亞硒酸鈉的甘藍硝酸鹽含量比對照組下降更快，發酵6 d后降至0.057 g/kg；亞硝酸鹽含量隨發酵時間先增大后減小，對照組在發酵4 d時達到峰值，為9.273 mg/kg，而實驗組在提前至發酵3 d時到峰值，為7.058 mg/kg，且峰值更小，這與谷云等[23]的研究一致，因此添加亞硒酸鈉既可以促進發酵甘藍中硝酸鹽的快速減少，降低安全隱患，又可以降低亞硝酸鹽峰值，使亞硝峰提前達到，降低發酵周期[24-25]。

2.6 添加亞硒酸鈉的發酵甘藍感官評價

發酵6 d制備的發酵甘藍感官評價見表4。由表4可知，實驗組和對照組在色澤和組織狀態上無差異，但實驗組的酯香氣濃郁，感官評分比對照組高7分，因此添加亞硒酸鈉基本不影響甘藍的色澤和組織狀態，但明顯提升了發酵甘藍的酯香氣。

表4 發酵甘藍的感官評價結果Table 4 Sensory evaluation result of fermented cabbage

3 結論

通過添加亞硒酸鈉，接種植物乳桿菌和異常漢遜酵母發酵甘藍，研究了亞硒酸鈉對發酵過程中植物乳桿菌和異常漢遜酵母菌落數、pH、總酸、總酯、有機硒和亞硝酸鹽等指標的影響。結果表明，亞硒酸鈉能促進植物乳桿菌和異常漢遜酵母快速增殖，其濃度為60 μmol/L最適宜。添加適宜濃度的亞硒酸鈉，甘藍發酵液總酸增速快，pH也降低的更快，同時提高了總酯含量；通過植物乳桿菌和異常漢遜酵母的生物轉化，有機硒轉化率高達80.68%；硝酸鹽快速下降，亞硝峰峰值降低，且提前1 d出現。

對發酵甘藍進行感官評價，添加亞硒酸鈉對發酵甘藍的色澤和組織狀態無影響，但可顯著提升其酯香氣。添加亞硒酸鈉，提高了發酵甘藍總酸和總酯含量，顯著降低了亞硝酸含量，新增了有機硒，提升了發酵甘藍感官品質和整體質量。