轉化山楂黃酮的食用真菌篩選及其發酵工藝優化

程水明，潘惠雯，韓寒冰

（廣東石油化工學院生物與食品工程學院，廣東 茂名 525000）

山楂（Crataegus pinnatifidaBunge）為薔薇科山楂屬落葉灌木果實，是最早被列為食藥兼用的水果之一。山楂在我國分布廣泛，產量豐富，主要分布在中國中部與南部地區，是重要經濟作物[1]。山楂主要活性成分為黃酮、異黃酮類和有機酸類（山楂酸、酒石酸、檸檬酸等）[2]。山楂中黃酮類化合物的提取、活性評價（防心血管病、降血脂、消炎抗菌及抗腫瘤等）與發掘已成研究熱點[3-7]。目前有關山楂果實、葉、核（籽）中黃酮類化合物的提取與分離純化已有較多報道[8-11]，大部分是通過物理或化學手段從植物中直接提取，但該方法存在提取工藝復雜、產率低、大規模制備受限等問題。如何提高植物中黃酮的利用率，一直是科學家們探索的一個熱點。黃酮類化合物的生物合成途徑較短，在微生物中合成有很大優勢，近年來，隨代謝工程以及合成生物學技術的迅速發展，以生長快速、遺傳背景簡單、易于操作的模式微生物作為細胞工廠合成天然活性產物（如黃酮類化合物）成為研究熱點[12]。

利用微生物發酵中藥在千余年前就有應用，如淡豆豉、六神曲、豆黃等[13]?，F代發酵中藥研究始于20世紀80年代，主要集中在一些真菌的純種發酵，如冬蟲夏草、槐耳、靈芝等[13]，而利用食用真菌發酵山楂則鮮有報道；目前已發表的關于山楂總黃酮含量的測定方法主要為高效液相色譜法和可見分光光度法[17]。與高效液相色譜法相比，可見分光光度法具有適用性較廣、操作簡單、測試時間短、精密度高和準確度好等特點，基于此，本研究利用初篩出的20種食用真菌來發酵山楂，采用可見分光光度法測定總黃酮含量，以期篩選出適于發酵山楂的食用真菌，并優化其發酵工藝，為黃酮類化合物資源開發及山楂資源深度利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂：2020年10月采摘于廣東信宜成熟的大果山楂鮮果。

蘆丁標準品（含量＞98%）：南京都萊生物技術有限公司；硝酸鋁（分析純）：上海阿拉丁有限公司；乙醇（分析純）：西隴科學有限公司；硫酸鎂（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；亞硝酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：羅恩試劑有限公司；試驗用水為實驗室自制超純水。

20種食用真菌（桑黃（Fleckedflesh polypore）、長根菇（Pleurotus nebrodensis）、黑平菇（Pleurotus ostreatus）、繡球菌（Sparassis crispa）、蛹蟲草（Cordyceps militaris）、灰褐香蘑（Lepista panaeola）、茯苓（Wolfiporia cocos）、玉覃離褶傘（Lyophyllum shimeji）、金針菇（Flammulina velutipes）、香菇（Lentinula edodes）、野蘑菇（Agaricus arvensis）、白小圈齒麟傘（Pholiota albocrenulata）、毛栓菌（Trametes hirsuta）、裂褶菌（Schizophyllum commune）、滑菇（Pleurotus ostreatus）、毛柄庫恩菇（Kuehneromyces mutabilis）、黃傘（Pholiota adiposa）、蜜環菌（Armillaria mellea）、猴頭菇（Hericium erinaceus）、阿魏菇（Pleurotus ferulae））：中國農業科學院菌種保藏中心。

液體培養基：馬鈴薯汁20%，葡萄糖2%，蛋白胨0.2%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.15%，pH自然。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

FA2104電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司；DF-15高速萬能粉碎機：浙江溫嶺市林大機械有限公司；DHG-9073BS-Ⅲ電熱鼓風干燥箱：上海新苗醫療器械有限公司；CR-080S超聲波清洗器：深圳市春霖清洗設備有限公司；V-5000型722分光光度計：上海元析儀器有限公司；RE-2000A旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；SPX-250B人工智能生化培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司；L5S紫外可見分光光度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；TG16A-WS臺式高速微量離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；NRY-1102立式恒溫搖床：上海南榮實驗室設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵液制備

將供試食用真菌接種于液體培養基，25 ℃、100 r/min搖床培養3 d得種子液；將山楂除雜，于50 ℃條件下烘干，粉碎過100目篩，以4%添加量加入液體培養基中，滅菌后按接種量5%（V/V）接入培養基，得山楂發酵液。

1.3.2 食用真菌發酵山楂工藝優化

菌株選?。喊凑?.3.1進行山楂發酵液制備，以總黃酮含量為考察指標，選取發酵液中總黃酮含量最高的食用真菌作為后續發酵工藝條件優化用菌株。

單因素試驗：在培養基和其他條件不變情況下分別考察發酵溫度（20.0 ℃、22.5 ℃、25.0 ℃、27.5 ℃、30.0 ℃、32.5 ℃）；發酵時間（3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d）；料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（g∶mL））；接種量（1.5%、3.0%、4.5%、6.0%、7.5%、9.0%）對發酵液總黃酮含量的影響。

響應面試驗：在單因素試驗的基礎上，選取發酵時間（A）、發酵溫度（B）、接種量（C）和料液比（D）4個因素作為自變量，以發酵液總黃酮含量（Y）為響應值，進行4因素3水平的響應面分析，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 食用真菌發酵山楂工藝優化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for hawthorn fermentation process optimization by edible fungi

1.3.3 總黃酮含量測定[18]

標準曲線繪制：精密稱取5.00 mg蘆丁對照品，用體積分數30%的乙醇定容至25 mL，得0.20 mg/mL蘆丁標準品溶液。依次取0、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL蘆丁標準品溶液，分別加入0.3 mL 5%NaNO2靜置5 min，加0.3 mL 10%Al（NO3）3靜置6 min，2 mL 4%NaOH，體積分數60%乙醇定容至10 mL，放置15 min后于波長510 nm處測吸光度值；以蘆丁含量（x）為橫坐標，OD510nm值（y）為縱坐標繪制標準曲線，求回歸方程，確定相關系數。

1.3.4 試驗數據處理

采用Excel 2010對試驗數據進行收集整理；用Origin 9.0對菌種篩選、單因素試驗數據進行繪圖；用Design Expert 12.0中的Box-Behnken進行方差和響應面優化分析。

2 結果與分析

2.1 食用真菌發酵菌種篩選結果分析

20種食用真菌在相同條件下與山楂液體培養基進行共發酵，以總黃酮含量為考察指標，篩選轉化效率最高的食用真菌，結果見圖1。

圖1 20種食用真菌發酵山楂總黃酮含量比較Fig. 1 Comparison of total flavonoids contents of fermented hawthorn by 20 edible fungi

由圖1可知，山楂經食用真菌發酵后總黃酮含量均比未經發酵時有所增加，表明經食用真菌發酵可有效促進山楂中總黃酮類化合物的形成和釋放。其中經蛹蟲草發酵后的發酵液中總黃酮含量最高，為33.8 mg/g，是空白對照（19.2 mg/g）的176%。因此后續試驗中選用蛹蟲草作為試驗用菌種。

2.2 蛹蟲草發酵山楂單因素試驗結果

2.2.1 發酵溫度對山楂基發酵液總黃酮含量的影響

由圖2可知，發酵溫度為20.0～22.5 ℃時，山楂基發酵液中總黃酮含量緩慢增加，25 ℃時達最高值36.0 mg/g，隨后趨于穩定。原因是溫度低時酶活性低，真菌生長及代謝慢；隨溫度升高，微生物生化反應速率和生長速率加快，對基質的吸收和分解增加；因黃酮不耐高溫，高溫會引起分解或結構變化，導致總黃酮含量略有降低。因此選擇最佳發酵溫度為25 ℃。

圖2 發酵溫度對山楂基發酵液中總黃酮含量的影響Fig. 2 Effect of fermentation temperature on total flavonoids contents in hawthorn fermentation broth

2.2.2 發酵時間對山楂基發酵液總黃酮含量的影響

由圖3可知，隨發酵時間延長，總黃酮含量逐步增加，發酵第7天時達最高值35.2 mg/g，隨后略有下降但總體趨于穩定?？赡苁且驗?～5 d內真菌群體數量少，生長緩慢且以菌體生長為主，代謝產物積累少，轉化的總黃酮量也相對較少；5～7 d內真菌生長進入快速生長期，代謝旺盛，轉化山楂中總黃酮速度加快，總黃酮含量增長快，7 d后達峰值。因此選擇最佳發酵時間為7 d。

圖3 發酵時間對山楂基發酵液中總黃酮含量的影響Fig. 3 Effect of fermentation time on total flavonoids contents in hawthorn fermentation broth

2.2.3 料液比對山楂基發酵液總黃酮含量的影響

由圖4可知，隨著料液比的變化，山楂基發酵液中總黃酮含量不斷增加，在料液比為1∶35（g∶mL）之前增長較快，隨后雖仍在上升但增加緩慢，這是因為隨發酵液體積增加，山楂粉與發酵液接觸面積增加，加快了黃酮類化合物溶出，但發酵液用量過大，后續步驟耗能亦會相應增加。因此選擇最佳料液比為1∶35（g∶mL）。

圖4 料液比對山楂基發酵液中總黃酮含量的影響Fig. 4 Effect of solid-liquid ratio on total flavonoids contents in hawthorn fermentation broth

2.2.4 接種量對山楂基發酵液總黃酮含量的影響

由圖5可知，隨接種量在1.5%～6.0%范圍內的增加，山楂基發酵液總黃酮含量呈增加趨勢，接種量為6.0%時達最高值39.6 mg/g，隨后趨于穩定；接種量＞6.0%時，菌體群體過大，生長限制因子不足，導致真菌菌體自身衰老或發生自溶等，從而影響后續黃酮的分離。因此選擇最佳接種量為6.0%。

圖5 接種量對山楂基發酵液中總黃酮含量的影響Fig. 5 Effect of inoculum on total flavonoids contents in hawthorn fermentation broth

2.3 響應面法優化蛹蟲草發酵山楂工藝條件

2.3.1 響應面試驗設計及結果

在單因素試驗基礎上，以總黃酮含量（Y）為響應值，選取發酵時間（A）、發酵溫度（B）、接種量（C）和料液比（D）4個因素進行響應面試驗，響應面試驗設計與結果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 蛹蟲草發酵山楂工藝優化響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiments for hawthorn fermentation process optimization by Cordyceps militaris

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Results of variance analysis of regression model

利用Design Expert 12.0對響應面試驗結果（表2）進行多元回歸擬合，得到發酵時間、發酵溫度、接種量、料液比對山楂發酵液總黃酮含量影響的二次多項式回歸模型：Y=2.60+0.066 7A+0.009 2B-0.133 3C+0.014 2D+0.020 0AB-0.075 0AC+0.005 0AD-0.002 5BC-0.030 0BD+0.017 5CD-0.416 8A2-0.253 1B2-0.441 8C2-0.050 6D2。

2.3.2 響應面顯著性及方差分析

模型方差分析結果（表3）表明，回歸模型P＜0.000 1，極顯著，模型的實際值與預測值線性擬合決定系數為0.984，說明模型能解釋98.4%的響應值變化，誤差小，模型F=61.44、調整決定系數R2Adj=0.968，變異系數3.40%，表明試驗精確度良好，方程模型擬合度較好。一次項A、C，二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），交互項AC，二次項D2對結果影響顯著（P＜0.05），一次項B、D，交互項AB、AD、BC、BD、CD對結果影響不顯著（P＞0.05）。4個因素對結果影響主次排序為C＞A＞D＞B，即接種量＞發酵時間＞料液比＞發酵溫度。

2.3.3 響應曲面圖交互分析結果

響應曲面圖中曲線走勢越陡，表明該因素影響越顯著；反之，走勢平滑則表明該因素影響較小[21-22]。等高線為橢圓形表明兩因素的交互作用顯著，圓形則代表交互作用不顯著。由圖6可知，發酵時間（A）與接種量（C）的等高線呈橢圓形，表明A與C交互作用明顯。在發酵時間6～8 d，總黃酮含量隨發酵時間增加呈先升后降趨勢，上升較快，下降緩慢；接種量對發酵液中總黃酮含量的影響同樣呈先增后減趨勢。但A因子的曲面傾斜度小于C因子，即曲面更加陡峭，說明發酵時間較接種量對總黃酮含量影響更大。與表3方差分析中AC交互項的P=0.014 4＜0.05，A與C交互作用顯著的結果相一致。

圖6 發酵時間與接種量交互作用對山楂發酵液中總黃酮得率影響的響應曲面及等高線Fig. 6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between fermentation time and inoculum on total flavonoids yields in hawthorn fermentation broth

2.3.4 驗證試驗結果

通過Design-Expert 12.0擬合得到山楂發酵的最佳工藝參數為發酵時間7.095 d、發酵溫度25.040 ℃、接種量5.77%和料液比1∶35.556（g∶mL），在此條件下總黃酮含量預測值為41.5 mg/g。為實際操作方便，修正工藝參數為發酵時間7 d、發酵溫度25 ℃、接種量6.0%和料液比1∶35（g∶mL），在此優化條件下進行5次驗證試驗，山楂發酵液中總黃酮含量平均值為42.8 mg/g，與預測值41.5 mg/g誤差很小，表明優化發酵工藝穩定，重復性好。

2.4 討論

微生物轉化是增加天然產物多效性有效方法之一，已廣泛應用于食品、工業、醫藥等多個領域[23]，但在山楂中應用甚少，付莉莉等[24]采用5種食用真菌通過正交設計試驗與山楂共發酵，結果為冬蟲夏草發酵效果最好，結論為利用食用真菌發酵山楂總黃酮含量明顯高于傳統提取方法，且條件溫和可保留其有效成分不被高溫分解，但存在供試菌種少、代表性不全面，所采用的正交試驗方法無法在試驗范圍內確定影響因素的最佳組合和響應值的最優值等不足。為系統、全面探究食用真菌發酵山楂的發酵工藝，本研究選取了20種食用真菌與山楂共發酵，以總黃酮的含量為考察指標，得出生長率、轉化率最高的食用真菌。結果顯示，經蛹蟲草與山楂共發酵后發酵液中總黃酮含量最高，為空白對照的1.76倍；通過響應面試驗優化發酵工藝，因為響應面法既能提供各影響因子的交互作用，又能確保試驗值與理論值相差較小，具有精確度高的特點[25-26]。

3 結論

通過響應面優化分析得到總黃酮發酵最佳工藝條件：發酵時間7 d、發酵溫度25 ℃、接種量6.0%、料液比為1∶35（g∶mL）。在此條件下，山楂發酵液中總黃酮含量為42.8 mg/g，進一步證明通過微生物輔助發酵是可以有效提高山楂發酵液中總黃酮的含量，其原因可能與微生物中某種酶催化了某些總黃酮類化合物前體及酶還原某些總黃酮類化合物的衍生物有關，但中藥發酵過程復雜，總黃酮含量增加的機制是什么，還有沒有其他微生物可更大幅度提高總黃酮含量，這些問題尚需進一步研究。微生物輔助發酵可有效提高山楂中總黃酮的含量，響應面優化得到的共發酵工藝具有總黃酮含量高、精度高、工藝穩定的優點，可在生產中應用并推廣。