基于熒光原位雜交法剖析窖泥微生物的預處理條件探究及應用

吳冬梅，袁永飛，田殿梅，薛正楷，3，李 進，周榮清

（1.瀘州職業技術學院郎酒學院，四川 瀘州 646000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.瀘州市生物醫學工程研究所，四川 瀘州 646000；4.四川大學輕紡與食品學院，四川 成都 610065）

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，濃香型、醬香型、清香型、米香型白酒是其四大基本香型白酒，其中尤以濃香型白酒銷量最大，占白酒銷量的70%左右[1-2]。泥窖固態發酵是濃香型白酒生產的一個重要特征，窖泥質量與濃香型大曲酒質量有一定關系[3]，窖泥微生物的優劣直接關系到白酒產品質量的優劣，優質老窖才能生產好酒[4-6]，在長期訓化過程中，形成了窖泥中獨特的微生物群落結構。因此認識白酒釀造過程中微生物的群落結構，尤其是定量地認識不同種類功能菌體的組成特點及變化規律，借此了解微生物作用與白酒質量的關系具有重要意義。

目前，研究白酒釀造過程中微生物群落結構的方法主要有傳統可培養分離鑒定法、代謝指紋技術-群落水平生理特征圖譜（community level physiological profiles，CLPPs）、基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的現代分子生物學方法（變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、末端限制性片段長度多態性技術（terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RLFP）及基于磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）的生物標記法等方法。如徐占成等[7]采用微生物分離技術從劍南春天益老號窖泥中選育到1株產己酸能力（18 000 mg/L）較高的菌株，并經16S rDNA序列分析和Biolog分析鑒定為生孢梭菌（Clostridium sporogense）；盧振等[8]采用PCR-DGGE技術分析窖泥細菌群落，結果表明，窖泥中4個優勢門類微生物分別為擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacterium）、變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）；劉琨毅等[9]采用磷脂脂肪酸生物標記法研究不同老熟方法的窖泥微生物群落結構，結果表明，在使用窖泥老熟方法的窖泥中，革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、好氧菌、厭氧菌及真菌的含量均隨著釀酒輪次的增加而增加，且微生物含量逐漸趨近于50年以上窖齡窖池窖泥；李俊輝等[10]采用高通量分析研究華北地區濃香型白酒窖泥樣品中微生物的群落結構，解析濃香型白酒不同窖齡窖泥中優勢和特征微生物。但以上方法在微生物群落結構研究中的靈敏度、精確性有待提高。熒光原位雜交技術（fluorescent in situ hybridization，FISH）是指以熒光標記的寡核苷酸探針與處理后的微生物內目標序列以堿基互補配對原則雜交，再通過熒光顯微鏡觀察目標基因微生物的細胞形態、分布以及數量的可視化技術[11]，該技術具有快速、精確、原位以及可動態觀察等特點[12]，能快速、準確、可視化的研究自然或人工環境中的微生物個體。

濃香型白酒釀造微生物的棲息地營養組分復雜，酸度、乙醇含量高，正是由于樣品復雜的體系性質及微生物群落多樣性，迄今難以客觀、全貌、快速、可視化的定量描述微生物群落結構特征，尤其是窖泥中植物殘渣、腐殖酸（humic acid，HA）[13]、土壤粒子及礦物質等雜質會導致自熒光，另外窖泥中較高含量的腐殖酸還會干擾核酸延伸與雜交[14-15]，影響FISH檢測結果。本研究以濃香型白酒窖泥為研究對象，優化窖泥樣品的預處理條件，并利用FISH法檢測大腸桿菌（Escherichia coli）和植物乳桿菌（Lactobacillus planetarium）的回收率，驗證預處理條件的可行性。最后在優化條件下檢測不同窖齡窖池窖泥樣品中細菌及古菌的數量，開發可視化揭示釀酒微生物群落數量變遷規律的方法，為釀酒微生物（尤其是從種的層面上設計探針、檢測菌體）群落結構及變化規律的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α：四川省微生物資源保藏中心；植物乳桿菌（Lactobacillus planetarium）滬1.08：上海市釀造科學研究所。

細菌探針EUB338（5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'，5'端cy3標記）、古菌探針ARCH915（5'-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3'，5'端cy3標記）：上海生工生物有限公司。

窖泥樣品：參考文獻[16]，從瀘州老窖股份有限公司取樣，分別為試驗窖池（1年）（窖池編號2108、2121）窖泥、50年窖齡窖池（窖池編號2131、2132）窖泥、100年窖齡窖池（窖池編號1960、1962）窖泥及300年窖齡窖池（窖池編號77、79）窖泥。

1.1.2 試劑

腐植酸、多聚賴氨酸（純度99%）：美國Sigma公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（分析純）：美國Roche公司；抗熒光猝滅封片液：海門碧云天生物技術有限公司；溶菌酶（酶活＞20 000 U/mg）：上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

BX-51熒光顯微鏡、CX31RTSF光學顯微鏡：日本奧林巴斯公司；Lambda 25型紫外可見分光光度計：美國Perkin Elmer公司；TGL16M高速離心機：湘麓離心機儀器有限公司；SW-CJ-2FD型凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 濃香型白酒窖泥預處理條件的優化

料液比的確定：稱取3.0 g 100年窖齡窖泥于含有約2.0 g波珠（直徑3～5 mm）的滅菌離心管內，首次分別以料液比為1∶6、1∶8、1∶10（g∶mL）的樣液比加入無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.2），渦旋振蕩混勻，超聲處理30 s（超聲頻率40 kHz、功率100 W），4 ℃、800 r/min條件下離心10 min，收集上清液；將下層沉淀分別以料液比為1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL）加入PBS，重復以上步驟2次。合并3次收集的上清液，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，棄上清液后加入PBS 10 mL重復洗滌一次并定容到10 mL，采用顯微鏡直接計數法[17]測定總菌數。同時，計數原窖泥樣品的總菌數，計算菌體損失率，確定最適樣液比。菌體損失率計算公式如下：

在此基礎上，依次考察離心轉速（400～2 000 r/min）、超聲波分散時間（0、30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s，30 s間歇操作）對窖泥菌體損失率的影響，確定最適離心轉速及超聲波分散時間。

Al2（SO4）3添加量的確定：分別取3.0 g 100年窖齡窖池窖泥樣品于含有玻珠的9支無菌離心管中，在首次加入1/2總體積最優樣液比的PBS后分別按濃度0、1.67×10-5mol/g窖泥、2.50×10-5mol/g窖泥、3.33×10-5mol/g窖泥、4.17×10-5mol/g窖泥、5.00×10-5mol/g窖泥、6.67×10-5mol/g窖泥、8.33×10-5mol/g窖泥、10.00×10-5mol/g窖泥加入Al2（SO4）3，其余操作按照前述確定的最優處理條件進行處理，測定總菌數，并計算不同Al2（SO4）3添加量時菌體損失率；同時參照文獻[18]測定HA含量，并計算HA去除率，以確定最佳Al2（SO4）3添加量。HA去除率計算公式如下：

1.3.2 細菌回收率測定

將一定量處于穩定期的E.coli和L.planetarium菌懸液分別加入3 g 100年窖齡窖泥樣品后，以未添加菌體的100年窖齡窖泥樣品為對照，經最優條件預處理后，得到菌體沉淀物。參照吳冬梅等[16，19]所述FISH法略微修改表征樣品中的菌體數量，同時FISH法分別計數E.coli和L.planetarium純菌體的菌體數量，并計算添加菌體的回收率，其計算公式如下：

1.3.3 FISH法在濃香型白酒窖泥樣品中的應用

基于細菌探針EUB338和古菌探針ARCH915，以不同窖齡窖池的窖泥為對象，按優化后的條件進行預處理，多聚甲醛固定后采用FISH測定菌體數量。

2 結果與分析

2.1 濃香型白酒窖泥預處理條件的優化

2.1.1 料液比的確定

不同料液比對窖泥樣品菌體損失率的影響見圖1。由圖1可知，隨著緩沖液的增加，菌體損失率逐步降低，可能是PBS的增加，在一定程度上降低了樣品懸浮液的黏度，改善了傳質環境及膠體性質，使更多菌體釋放到PBS緩沖液中。當料液比為1∶16和1∶20（g∶mL）時，菌體損失率差異不顯著（P＞0.05），分別為22.36%、20.77%，因此，綜合考慮確定最優料液比為1∶16（g∶mL）。

圖1 不同料液比對窖泥菌體損失率的影響Fig. 1 Effect of different ratio of material and solution on the cell loss rate in pit mud

2.1.2 離心轉速的確定

離心轉速對菌體損失率的影響見圖2。由圖2可知，隨著離心轉速的增加，菌體損失率逐漸增大，離心轉速為400r/min和800 r/min時，菌體損失率較低，分別為18.30%、24.60%?；诰C合考慮低菌體損失率和盡量去除腐殖質等雜質的目標，故選擇最優離心轉速為800 r/min。

圖2 不同離心轉速對窖泥菌體損失率的影響Fig. 2 Effect of different centrifugal rotation speeds on the cell loss rate in pit mud

2.1.3 超聲波分散時間的確定

超聲波分散時間對窖泥樣品菌體損失率的影響見圖3。由圖3可知，超聲處理時間在0～120 s的范圍時，隨著超聲處理時間的延長，從窖泥中解吸的總菌數略微增多，菌體損失率略微降低，當處理時間為120 s時菌體損失率最低。但繼續延長處理時間，超過150 s后，菌體損失率明顯增加，可能是長時間超聲處理使其菌體細胞壁破碎[20]，減少了檢出的總菌數。因此，為了盡量多的洗出菌體及保持菌體活性，選擇最優超聲分散時間為60 s。

圖3 不同超聲分散時間對窖泥菌體損失率的影響Fig. 3 Effect of different ultrasonic dispersion time on the cell loss rate in pit mud

2.1.4 Al2（SO4）3添加量的確定

窖泥樣品中加入Al2（SO4）3，可將腐植酸等雜質絮凝沉淀除去，減少對探針的干擾，改善FISH的可視化效果[21]。窖泥樣品經不同濃度的Al2（SO4）3溶液處理后，窖泥的菌體數、HA含量、菌體損失率及HA去除率見表1。由表1可知，Al2（SO4）3添加量在0.00～10.00×10-5mol/g窖泥范圍內，隨著Al2（SO4）3添加量的增加，除去HA作用增強，菌體損失率也逐漸增大，當Al2（SO4）3添加量＞5.00×10-5mol/g窖泥之后，菌體數較低，HA含量也極低。由于窖泥樣品中的腐植酸、礦物質等雜質的自發熒光強烈，嚴重干擾了真細菌和古生菌的可視化和定量檢出，結合HA要有較高的去除率及菌體損失率盡量要少，因此，確定Al2（SO4）3的添加量為4.17×10-5mol/g窖泥。

表1 不同Al2(SO4)3添加量對菌體數及腐殖酸含量的影響Table 1 Effects of different Al2(SO4)3 addition on microbial number and humic acid contents

2.2 FISH法測定窖泥樣品中細菌的回收率

將純培養的E.coli、L.planetarium菌體加至窖泥中，采用FISH法測定窖泥樣品中E.coli、L.planetarium的菌體數，熒光圖見圖4。由圖4可知，與吳冬梅等[16]的研究結果一致，經過預處理后，菌體在熒光顯微鏡下清晰可辯，窖泥樣品中的腐植酸、礦物質等雜質的自發熒光干擾明顯降低；通過對比，可見L.planetarium的菌體個體較大。采用FISH法檢測E.coli、L.planetarium的菌體數量，二者菌體的回收率分別為62.50%和55.44%，前者回收率略高，可能是由于該菌是革蘭氏陰性菌，探針更易進入菌體，雜交效果較好；還有可能是因為L.planetarium菌體個體相對略大可能在低速離心時菌體損失略大而使得其檢出率略低，這與BOUVIER T等[22]的研究結果相似。此外，BATTION T J等[23]基于細菌通用探針EUB338，采用FISH法檢測因時間而異冰川溪流泥沙沉積物中菌體的檢出率為22%～56%。說明針對窖泥這個復雜樣品，該預處理條件對窖泥微生物的FISH檢測是可行的。

圖4 添加大腸桿菌（A）及植物乳桿菌（B）窖泥樣品微生物熒光圖Fig. 4 Microbial fluorescence of the pit mud samples with Escherichia coli (A) and Lactobacillus planetarium (B) addition

2.3 FISH法檢測不同窖齡窖池窖泥微生物數量的結果

不同窖齡窖泥微生物的FISH檢測結果見圖5及表2。

圖5 不同窖齡窖泥樣品微生物熒光圖Fig. 5 Microbial fluorescence of different pit age

表2 FISH法檢測不同窖齡窖泥樣品中菌體量Table 2 Number of cells in different pit mud samples detected by FISH×108個/g

由圖5可知，窖泥樣品經Al2（SO4）3處理后，菌體可辨，菌體呈桿狀、螺旋狀及球狀。由表2可知，隨著窖齡的增加，窖泥樣品中細菌、古菌及菌體總數總體均呈現出先增加后降低的趨勢，且基本上在100年窖齡窖池窖泥中達到最高，而在1年窖齡窖池窖泥中菌體量最少，總菌數僅為1×108個/g左右，這可能是菌體在特定環境中逐漸馴化的結果。這與一些文獻中的結論是較吻合的，如岳元媛等[24]利用平板涂布可培法研究瀘州老窖不同窖齡窖泥樣品中兼性厭氧細菌數量，得出新窖泥中微生物數量較老窖泥低；胡承等[25]研究不同窖齡窖泥樣品中微生物數量，結果表明老窖泥中的厭氧異氧菌、甲烷菌、己酸菌及硫酸鹽還原菌的數量都比新窖泥中多；余有貴等[26]研究湖南湘窖酒業不同窖齡窖泥樣品（0年、2年、16年、33年），結果表明微生物各類群總數呈上升趨勢。

3 結論

本研究確定窖泥樣品的最優預處理條件為料液比1∶16（g∶mL）、離心轉速800 r/min、超聲分散時間60 s、Al2（SO4）3添加量為4.17×10-5mol/g窖泥。在此條件下，將E.coli、L.planetarium培養物分別添加到窖泥樣品中，采用FISH法檢測到兩種菌的菌體回收率分別為62.50%和55.44%，說明該條件對于窖泥這個復雜樣品的FISH檢測是可行的，可以提高總菌數的檢出量、準確性和減少窖泥自熒光的干擾，顯著改善FISH可視化效果。采用優化后的條件對不同窖齡窖池窖泥進行預處理，應用FISH法研究窖泥樣品中微生物群落結構，結果表明，隨著窖齡的增加，窖泥樣品中細菌、古菌及菌體總數差異明顯，總體呈現出先增加后降低的趨勢，基本上呈現出在100年窖齡的窖泥樣品中，微生物總量最高。