17種市售廣式醬油中風味物質的檢測分析

陳 杰，趙 瑩，韓舜羽，白衛東*，劉曉艷

（1.廣東粵師傅調味食品有限公司，廣東 開平 529300；2.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225）

醬油的香氣是決定其產品質量的重要因素之一，雖然在醬油組分中的含量甚微，但其成分極為復雜，對醬油的風味有極大的影響，是體現醬油風味特征的重要元素之一[1]。根據醬油中揮發性風味物質的化合物結構特點，一般將其分為酯類、醇類、酚類、吡嗪類、酮類、酸類、呋喃類、含硫類與其他含氮類化合物。醬油的香氣物質容易揮發，香氣的優劣就成為了人們對其風味的第一印象。因此，對醬油中揮發性風味物質的剖析尤為重要。醬油中的呈味物質按化合物種類分，主要有有機酸、游離氨基酸、核苷酸、小分子肽、有機堿及糖醇等。除了揮發性風味物質，氨基酸與有機酸也是評價醬油品質的重要指標，醬油中酸味的重要成分是主要是有機酸。具有多種味道的游離氨基酸決定了食品味道鮮美的程度，不僅是醬油典型風味的重要組成部分也是決定醬油類型的主要依據之一[2]。為探究市售廣式醬油的風味區別及鑒定出重要的風味物質，本文對17種不同品牌，不同等級的市售醬油進行揮發性風味物質、氨基酸與有機酸的檢測，對各風味物質進行定性定量，并通過香氣活性值或滋味活度值篩選出醬油中起重要貢獻的物質。以期對廣式醬油的風味及未來發展正提供一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

17個醬油樣品（分別編號為A（特級）、A1（一級）、A3（三級）、B（特級）、C（特級）、D（特級）、E（特級）、F（特級）、G（特級）、G1（一級）、G2（二級）、G3（三級）、H（特級）、I（特級）、I1（一級）、I2（二級）、I3（三級），字母相同為同一品牌）：均產自廣東省。

二甲基-三庚酮：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；氨基酸標品：美國Sigma公司；緩沖液B1、B2、B3、B4、B5、B6（均為色譜純）：日本日立公司；磷酸二氫鉀、磷酸、硫酸鋅（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；亞鐵氰化鉀（分析純）：天津市福晨化學試劑廠；甲醇（色譜純）：麥瑞達公司；L-焦谷氨酸（純度＞98%）：上海麥克林生化科技有限公司；乙酸、L-酒石酸、無水檸檬酸、L-蘋果酸、L-乳酸、琥珀酸、草酸（純度均＞98%）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

6890-5973型氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS），DB-WAX毛細管色譜柱（30 m×0.25mm×0.25 μm）、1260型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、ZORBAX SB-Aq色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美國Agilent科技有限公司；85-2型數顯控溫磁力攪拌器：常州市金壇大地自動化儀器廠；57330-U型固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）手動進樣手柄：美國Supelco公司；100 μm 聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）型萃取纖維：美國Supelco公司；5810R型多功能臺式離心機：德國艾本德公司；KQ5200V型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；Hitachi L-8900型全自動氨基酸分析儀：日立高新技術公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 揮發性風味物質的檢測方法

樣品前處理：取一顆Φ8 cm的轉子放入干燥好的固相微萃取瓶，加入20 μL質量濃度166 mg/L的二甲基三庚酮甲醇及8 mL醬油，放入水浴60 ℃條件下平衡10 min，使用100 μm PDMS萃取針在轉速1 100 r/min、60 ℃條件下萃取45 min，解吸5 min，萃取頭首次使用時，在規定溫度條件下老化至無雜峰，兩個樣品間燒針10 min。

GC-MS條件：DB-WAXUI毛細柱色譜柱（30m×0.25mm×0.25 μm）。進樣口溫度230 ℃，不分流模式。載氣為高純氦氣（He），流速1 mL/min。升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升至180 ℃，保持0 min，再以3 ℃/min升至220 ℃，保持7 min，后運行5 min。離子源為電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV；連接口溫度250 ℃；質量掃描范圍33～330 amu。

定性定量方法：在美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）02.L質譜數據庫檢索和標準譜圖比較對未知化合物進行檢索，并利用內標（二甲基三庚酮-甲醇）的濃度與檢測出的各物質峰面積計算物質的含量。

1.3.2 氨基酸的檢測方法

樣品前處理：稱取1 g醬油樣品，加1 mL體積分數15%的磺基水楊酸沉淀蛋白，用水定容至25 mL容量瓶中，取部分置于離心管中，10 000 r/min離心10 min，再取上清液1 mL稀釋至25 mL容量瓶，加水定容，取一定量壓濾進樣。

標準溶液的配制及標準曲線的繪制：用標準樣品配制一系列不同濃度的標準液，壓濾氨基酸分析儀測試，以氨基酸質量濃度為橫坐標，各氨基酸峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

色譜檢測條件：色譜柱為ZORBAX SB-Aq柱（4.6 mm×250 mm）；流速：0.4 mL/min（pump1），0.35 mL/min（pump2）；檢測波長：570 nm、440 nm；柱溫：57 ℃；進樣體積：20 μL；流動相按表1進行梯度洗脫，反應溫度：135 ℃，分析時間35 min。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient eluting program

1.3.3 有機酸的檢測方法

標準溶液的配制及標準曲線的繪制：分別準確稱取草酸8.3 mg，酒石酸39.4 mg，蘋果酸88 mg，乳酸56.8 mg，乙酸143.5 mg，檸檬酸60.6 mg，焦谷氨酸14.4 mg，丁二酸106 mg，混合定容至25 mL，混合均勻，取標準溶液分別稀釋成20 μL/mL、100 μL/mL、200 μL/mL、400 μL/mL、600 μL/mL、800 μL/mL與原始標準溶液濃度1 000 μL/mL，7個濃度梯度，進樣10 μL，采用外標法進行定量處理，以有機酸含量為橫坐標，色譜峰的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

樣品前處理[4]：精密吸取1 mL樣品于50 mL離心管中，用水定容至10 mL，加入2 mL 10.6%亞鐵氰化鉀溶液混勻后，再加入2 mL 30%硫酸鋅溶液，加水定容至40 mL后靜置30 min以上，6 000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm水系濾膜，取過濾液上樣。

HPLC色譜條件[5]：色譜柱ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm×5 μm），流動相A為甲醇，流動相B為0.01 mol/L KH2PO4溶液（用磷酸調pH到2.83），兩者比例為3∶97，流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃，紫外檢測波長214 nm，進樣量10 μL。

1.3.4 香氣活力值、滋味活度值計算

香氣活性值（odor activity value，OAV）是評價香氣化合物重要性的一個指標，OAV＞1則對樣品香氣組成有貢獻，OAV越大，該香氣化合物貢獻越大，其計算公式如下：

滋味活度值（taste active value，TAV）與OAV一樣，都是濃度與閾值之比得到的數據，是用來評價風味物質貢獻度的一個指標，當TAV＞1時，表明該滋味物質對樣品滋味有顯著影響，且數值越大，貢獻作用越大；當TAV＜1時，表明該滋味物質對整體滋味貢獻不顯著，其計算公式如下：

1.3.5 數據處理

采用Origin 8.5和Excel 2018對數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 17種市售廣式醬油中揮發性風味物質含量分析

2.1.1 17種市售廣式醬油中各類揮發性風味物質的占比分析運用GC-MS對17種市售廣式醬油的揮發性風味物質進行檢測，結果見圖1。

圖1 17種市售廣式醬油中揮發性風味物質含量比例Fig. 1 Content proportion of volatile flavor substances in 17 kinds of commercially available Cantonese soy sauce

由圖1可知，17種市售廣式醬油中共檢測出245種揮發性風味物質，總含量為2 894.9～16 492.3 μg/kg。包括酸類11種（971.47～5 760.54 μg/kg）、醛類21種（67.54～260.54 μg/kg）、酚類26種（197.62～143.75 μg/kg）、吡嗪類22種（147.93～379.34 μg/kg）、酮類43種（672.19～1 542.97 μg/kg）、酯類51種（220.09～560.42 μg/kg）、醇類32種（452.63～6 967.54 μg/kg）、含硫化合物8種（17.54～62.49 μg/kg）、呋喃類9種（33.64～104.37μg/kg）和其他含氮類化合物（除了吡嗪）22種（114.25～742.63 μg/kg）。主體揮發性風味成分由酸類、醇類、酯類及酚類組成。

醬油C、A3、G2的酸類物質含量很大（60%、56%、46%），主要的酸類有乙酸和山梨酸，其中乙酸在每種醬油中均有檢測到，有些醬油山梨酸過多，可能原因是山梨酸鉀添加過多。醬油A、B的醇類物質含量最大（71%、52%），主要的醇類有苯乙醇和乙醇，其中苯乙醇在每種醬油中均檢測到，苯乙醇有玫瑰樣的香氣，先苦后甜的桃子味道，以游離態或酯化結合態存在于某些天然產物中[8]。乙醇含量也很高，但僅在6個樣品中檢出。醬油E、D中的酯類含量最大（68%、32%），主要的酯類有十六烷酸乙酯、亞油酸乙酯、苯乙酸乙酯等，其中十六烷酸乙酯在每種醬油中均檢測到，十六烷酸乙酯與亞油酸乙酯屬于高級脂肪酸酸，是豆類等在釀造過程中產生的具有典型果香味的物質，該類物質使釀造醬油的香氣更濃郁、協調[9]。醬油D、A1中的酚類含量最大（48%、34%），主要的酚類有乙基愈創木酚、愈創木酚與4-乙基苯酚。醬油釀造過程中，酚類物質主要是通過曲霉的降解作用生成的，具有香氣特征明顯、活性強的特征，對醬油風味有較大的貢獻[7，10]。醛類物質在醬油中含量相對較少，各醬油中醛類相對含量在0～7%，醛類物質主要來自氨基酸降解、微生物的轉化作用和油脂的氧化降解，有些醛類物質本身不是呈味成分，但醛類化合物一般可與醇類發生反應生成醬油特有的香氣成分[9]。主要的醛類有5-甲基-2-苯基-2-己烯醛（堅果香、可可香、青香）與苯乙醛，這兩種物質分別在12種醬油中檢測出。吡嗪是一類具有堅果香，焦香味的物質。是醬油中重要的風味物質，其中醬油A的吡嗪最突出，相對含量為12%，其他醬油中的吡嗪類較少，相對含量在0～6%。醬油A1中酮類物質相對含量最大，主要的酮類有巨豆三烯酮與香葉基丙酮，前者在各樣品中均有檢測到，后者具有新鮮、清淡的花香香氣。含硫化合物雖然相對含量不高，占比在0～2%，但對整體風味有很大影響，它們來自含硫氨基酸、肽等的降解，主要檢測到的含硫類化合物是3-（甲硫基）-1-丙醇，在5種醬油中檢出，低濃度時有強烈芬芳的肉或肉湯香氣和滋味。呋喃類化合物及糠醛在微生物作用下會產生一定的化學反應，使反應物產生谷物香氣及咖啡香氣，主要的呋喃類有3-苯基-呋喃，據文獻報道，3-苯基-呋喃具有甜香味[11]。2-乙?；量┦侵饕獧z測到的含氮類化合物（除了吡嗪類），每種醬油中均檢測到，其具有焦糖香與甜香[11]。

2.1.2 市售醬油中各類揮發性風味活性物質的定量分析

為了進一步明確各種醬油的主體風味成分，采用香氣活性值分析了17種市售廣式醬油間的主體風味成分構成，結果見表2。

表2 17種市售廣式醬油關鍵香氣組分的香氣活性值Table 2 Aroma activity values of key aroma components in 17 kinds of commercially available Cantonese soy sauce

由表2可知，17種市售廣式醬油樣品中，均被檢測到的物質是苯乙醇，苯乙醇（含量69.79～11 079.31 μg/kg）在部分醬油中貢獻突出。另外，苯乙醛（含量43.62～92 052.78 μg/kg）、4-乙基愈創木酚（含量71.47～13 086.21 μg/kg）、愈創木酚（含量79.78～11 542.93 μg/kg）與3-苯基-呋喃（含量52.61～10 009.73 μg/kg）雖然不是每種醬油中都有檢測到，但OAV都比較高，推測以上5種揮發性風味物質可能是廣式醬油中重要的活性物質。趙謀明等[11]使用HS-SPME-GC-MS/O聯用分析了醬油中香氣活性化合物的結果顯示，這5種物質均被檢出且風味強度在2.7及以上。乙酸乙酯、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、3-甲基-丁醛、2-異丁基-3-甲基吡嗪在醬油中的OAV也較高，但僅在個別醬油中有檢出，說明這些物質的有無是區別不同醬油產生不同風味的原因。

雖然不同醬油的風味存在著一定的差異，且不同醬油間風味化合物的組成及含量各不同，但它們的主體香氣成分存在著相互交叉的關聯，各種化合物相互作用使各種醬油具有獨特的風味。

2.2 市售醬油的氨基酸結果分析

2.2.1 市售醬油中各氨基酸含量的占比分析

運用全自動氨基酸分析儀對17種市售醬油的16種呈味氨基酸進行檢測，結果見圖2。

由圖2可知，17種市售廣式醬油中16種呈味氨基酸的總含量為33.5～104.1 mg/g。其中天冬氨酸（Asp）含量為1.14～5.29 mg/g，蘇氨酸（Thr）0.98～2.60 mg/g，絲氨酸（Ser）1.36～3.57 mg/g，谷氨酸（Glu）4.85～77.24 mg/g，脯氨酸（Pro）0～2.80 mg/g，甘氨酸（Gly）0.76～2.01 mg/g，丙氨酸（Ala）1.28～5.07 mg/g，纈氨酸（Val）1.58～4.21 mg/g，蛋氨酸（Met）0～0.91 mg/g，異亮氨酸（Ile）1.28～3.54 mg/g，亮氨酸（Leu）1.82～5.29 mg/g，酪氨酸（Tyr）0.18～1.16 mg/g，苯丙氨酸（Phe）1.19～4.25 mg/g，賴氨酸（Lys）1.46～3.74 mg/g，組氨酸（His）0.16～0.94 mg/g，精氨酸（Arg）0.13～3.47 mg/g。

圖2 17種市售廣式醬油中氨基酸含量比例Fig. 2 Content proportion of amino acids in 17 kinds of commercially available Cantonese soy sauce

所有醬油樣品中，谷氨酸的含量普遍較高，其次是亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸等，而組氨酸、酪氨酸和蛋氨酸的含量較低，脯氨酸僅在3種醬油中檢測到。

通過比較可以發現，不同醬油中氨基酸的組成和含量均存在較大差異。如醬油中谷氨酸含量占氨基酸總量最高的達79%，最低的只有11%。據文獻報道，釀造醬油中的谷氨酸占總氨基酸的比例一般在18%～25%左右，如果超過該比例，則認為可能是添加了谷氨酸鈉作為增鮮劑[16]。不同品牌間，氨基酸的組成和含量存在較大差異，可能與各公司原料及工藝不同有關。

2.2.2 市售醬油中各氨基酸的滋味活度值

由表3可知，谷氨酸的TAV貢獻范圍為16.18～257.5，對醬油風味貢獻值最大且遠高于其他氨基酸，谷氨酸本身呈酸味，但以鈉鹽形式存在時具有很強的鮮味[17，24]；其次貢獻值較大的氨基酸有纈氨酸、丙氨酸與賴氨酸；而蘇氨酸、酪氨酸、甘氨酸與脯氨酸TAV普遍＜1，說明它們對醬油滋味貢獻程度較小。精氨酸的貢獻呈現兩極分化，在特級醬油中貢獻值較大，而非特級醬油的精氨酸貢獻值普遍很低。

表3 17種市售廣式醬油的氨基酸滋味活度值Table 3 Taste active values of amino acids in 17 kinds of commercially available Cantonese soy sauce

2.3 市售醬油的有機酸結果分析

2.3.1 市售醬油中各有機酸含量的占比分析

運用高效液相色譜儀對17種市售醬油的8種有機酸進行檢測，結果見圖3。

圖3 17種市售廣式醬油中有機酸含量比例Fig. 3 Content proportion of organic acids in 17 kinds of commercially available Cantonese soy sauce

由圖3可知，17種市售醬油中8種有機酸的總含量為42.1～323.5 mg/mL。其中草酸含0.71～2.31 mg/mL，酒石酸0.19～2.34 mg/mL，蘋果酸0～0.95 mg/mL，乳酸0.37～15.74 mg/mL，乙酸1.13～5.86 mg/mL，檸檬酸7.29～173.24 mg/mL，焦谷氨酸1.90～7.68 mg/mL，丁二酸23.78～193.16 mg/mL。

所有醬油樣品中，丁二酸與檸檬酸的含量占比最高，乳酸其次，乙酸、焦谷氨酸占比較少，草酸與酒石酸的含量最少。僅A、G2醬油含蘋果酸。其中，丁二酸呈酸鮮味，檸檬酸呈溫和爽快酸味，乳酸呈爽口酸略帶澀味，焦谷氨酸不呈味，乙酸與酒石酸呈刺激性酸味，蘋果酸呈爽快酸略帶苦味[18，22]，這些有機酸在酸味及風味方面對醬油的風味起到了一定的綜合作用。雖然焦谷氨酸在谷氨酰胺濃度較低時，可由谷氨酸轉化而成，但是焦谷氨酸并不呈鮮味[19，21]。據有關研究報道，醬油中的乙酸與乳酸占比較高[4，14]，也有研究顯示醬油的乳酸與焦谷氨酸占比較高[20，25]，而本試驗的結果是丁二酸或檸檬酸最高，具體原因有待進一步研究。

2.3.2 市售醬油中各有機酸的滋味活度值

由表4可知，丁二酸本身含量最大，由于閾值很小，呈味貢獻很突出。滋味活度值范圍為224.31～1 822.29，其次是檸檬酸范圍為16.20～384.98，酒石酸的活度值范圍為12.89～155.82，乙酸、乳酸與蘋果酸的活度值較低，范圍分別為9.42～48.84、0.29～12.49與0.48～1.91。丁二酸與檸檬酸兩種含量較高的有機酸在特級與非特級醬油之間有明顯差異，非特級的滋味活度值較低，而酒石酸、乳酸與乙酸的特級與非特級醬油之間無明顯差異。

表4 17種市售廣式醬油的有機酸滋味活度值Table 4 Taste active values of organic acids in 17 kinds of commercially available Cantonese soy sauce

3 結論

通過對17種市售廣式醬油的揮發性風味物質、氨基酸與有機酸進行了檢測、分析。結果表明，苯乙醇（69.79～11 079.31 μg/kg）、苯乙醛（43.62～92 052.78 μg/kg）、4-乙基愈創木酚（71.47～13 086.21 μg/kg）、愈創木酚（79.78～11 542.93 μg/kg）與3-苯基-呋喃（52.61～10 009.73 μg/kg）對廣式醬油香氣活性值（OAV）貢獻較大；谷氨酸（4.85～77.24 mg/g）對醬油滋味活度值（TAV）貢獻最大且遠高于其他氨基酸，其次是纈氨酸（1.58～4.21 mg/g）、丙氨酸（1.28～5.07 mg/g）與賴氨酸（1.46～3.74 mg/g）等；滋味活度值（TAV）貢獻最大的有機酸是丁二酸（23.78～193.16 mg/mL），其次是檸檬酸（7.29～173.24 mg/mL）。