親水作用色譜-串聯質譜法測定動物源運動食品中3種氨基糖苷類抗生素的殘留量

宮明明

（黃淮學院，河南 駐馬店 463000）

氨基糖苷類抗生素（aminoglycosides，AGs）是一類水溶性堿性抗生素，化學結構上包含兩個以上氨基糖并由配苷鍵與中心的己糖或戊糖相連[1-2]，是畜禽養殖領域較常使用的獸藥[3-4]。AGs藥物具有耳毒性和腎毒性等毒副作用，人類長期食用其殘留超標的食品將會危害人體健康。典型的代表藥物有鏈霉素、雙氫鏈霉素、新霉素、潮霉素B、安普霉素等，其中，新霉素、潮霉素B、安普霉素等屬于新型氨基糖苷類抗生素，能同時檢測多種目標物的方法標準尚未形成。為了防止通過食物鏈引起人體中毒，特別是以動物性組織為原料制成的動物源性運動食品這類特殊食品，有必要建立一種快速檢測其中這些組分的方法，加強AGs在動物源運動食品中的殘留監控。

由于潮霉素B、安普霉素和新霉素屬于強極性化合物，在常規反相色譜柱上保留性能不佳，強極性和高水溶性也給樣品前處理和色譜分離增加了難度[5-7]。采用溶劑萃取或者固相萃取的前處理方式處理動物源運動食品，目標物回收率不理想[8-10]。毛細管電泳、柱后衍生-高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法雖然簡便，但靈敏度不高[11-12]；高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法雖靈敏度較色譜方法有所提高，但是流動相中要加入離子對試劑，這會導致系統穩定性差以及會出現高離子強度抑制待測物電離的問題[13-14]。然而，親水作用色譜（hydrop interaction liquid chromatography，HILIC）是一種介于正相色譜和反相色譜之間的分離模式，可用于分析強極性和強親水性樣品，以及適用于分離在常規反相色譜上保留不佳的組分，且易與質譜聯用，可解決多種AGs的分離問題。

本研究通過利用基質固相分散（matrix solid phase dispersion，MSPD）技術對強極性較難分離的3種AGs進行提取后，通過優化親水交互作用色譜儀器條件以及前處理過程，建立親水交互作用色譜-串聯質譜（hydrophilic interaction liquid chromatography tandem mass spectrometry，HILIC-MS/MS）法檢測動物源運動食品中3種AGs的殘留量，克服了常規方法損傷質譜的缺陷，提高方法的實用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

潮霉素B（純度98.5%）、新霉素（純度99.0%）、安普霉素（純度98.0%）標準品：上海安譜實驗科學科技有限公司；動物源運動食品（雞胸肉源蛋白棒、牛肉源蛋白棒、乳清蛋白棒、雞胸肉運動代餐粉、牛肉運動代餐粉、蛋白運動能量棒）：市售；乙腈、甲酸（色譜純）：德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

API4000型高效液相色譜-串聯質譜儀：美國Waters公司；Sielc Obelisc R色譜柱（2.1 mm×100 mm，5 μm）：美國飛諾美公司；InertSustain Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、BEHHILIC色譜柱（2.1mm×100mm，3μm）：日本島津有限公司；TSKgel Amide-80色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）：美國沃特世公司；IKA MS3 basic渦旋混合器：IKA（廣州）儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

取2.0 g動物源運動食品、2.0 g二氧化硅填料和2.0 g乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）二鈉鹽混勻，裝入SPE管中，1.0 mL/min的流速下用10.0 mL純水淋洗，再用乙腈-甲酸溶液洗脫，收集洗脫液，定容至2 mL，用0.22 μm濾膜過濾后分析。

1.3.2 色譜條件的優化

固定色譜條件：進樣量3μL；柱溫35℃；流速0.3mL/min。

色譜柱的選擇：考察色譜柱種類（鍵合相為硅膠的BEH HILIC色譜柱、鍵合相為酰胺基的InertSustain Amide色譜柱、鍵合相為酰胺基的TSKgel Amide-80色譜柱以及鍵合相為含電荷的極性和非極性混合基團的Sielc Obelisc R色譜柱）對3種氨基糖苷類抗生素的分離效果，4種色譜柱中InertSustain Amide色譜柱以10 mmol/L乙酸銨-乙腈（10∶90，V/V）為流動相進行等度洗脫，其余3種色譜柱都以1.0%甲酸水溶液-乙腈（10∶90，V/V）為流動相進行等度洗脫。

流動相的選擇：考察了水-乙腈（10∶90，V/V）、1.0%甲酸水溶液-乙腈（10∶90，V/V）以及10 mmol/L乙酸銨-乙腈（10∶90，V/V）等溶液的等度洗脫效果，并對甲酸水溶液-乙腈（10∶90，V/V）流動相體系中不同甲酸含量（0.05%、0.10%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%）進行比較，以樣品的加標回收率考察提取效果。

基質效應的影響：為減少基質效應，盡量除去動物源運動食品中的干擾物質，在上述流動相等度洗脫的基礎上，收集每段淋洗液進樣檢測，最終確梯度洗脫程序[15-17]。

1.3.3 質譜條件

選用質譜檢測器的電噴霧離子源（electrosprayion source，ESI+）模式，離子源電壓為4 200 V，離子源溫度為380 ℃，掃描模式為多反應離子監測模式（multiple reaction monitoring，MRM），其他質譜檢測參數見表1。

表1 3種氨基糖苷類抗生素質譜檢測參數Table 1 Mass spectrometry detection parameters of 3 aminoglycoside antibiotics

1.3.4 方法學驗證

標準溶液的配制：配制不同質量濃度（5ng/mL、10ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL）的混合標準溶液，在優化好的色譜條件下檢測，以質量濃度（x）為橫坐標，響應強度為縱坐標（y）繪制標準曲線，其中以信噪比（S/N）=3計算檢出限（limit of detection，LOD），以信噪比（S/N）=10計算定量限（limit of quantitation，LOQ）。

穩定性及重復性實驗：在最優條件下，對潮霉素B、安普霉素和新霉素的混合標準溶液（50 ng/mL）進行HILICMS/MS檢測分析，連續測定7 d，每天進樣3次，測得3種化合物組分保留時間和峰面積的日間和日內相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

加標回收實驗：在空白樣品中分別添加低（100 μg/kg）、中（250 μg/kg）和高（500 μg/kg）三個水平混合標準品溶液，按照所建立的方法進行樣品前處理及測定，計算加標回收率及RSD。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇

不同色譜柱對3種氨基糖苷類抗生素的分離效果見圖1。不同鍵合固定相的色譜柱在分離目標物組分的過程中保留機制迥異[18-20]，這4款親水作用色譜柱（BEH HILIC色譜柱、Sielc Obelisc R色譜柱、TSKgel Amide-80色譜柱以及InertSustain Amide色譜柱）對3種AGs的分離效果也相差較大，其中BEH-HILIC柱分離3種目標物不出峰，其余3種色譜柱可以對目標物實現分離。

圖1 3種色譜柱對3種氨基糖苷類抗生素的分離效果Fig. 1 Effect of 3 chromatographic columns on the separation of 3 aminoglycoside antibiotics

由圖1可知，InertSustain Amide色譜柱在以10 mmol/L乙酸銨-乙腈（10∶90，V/V）為流動相等度洗脫模式下，可以實現3種氨基糖胺類抗生素的分離，但潮霉素B、新霉素會出現色譜峰分叉等現象，且目標物響應強度相應較弱；而Sielc Obelisc R色譜柱和TSKgel Amide-80色譜柱在以1%甲酸-乙腈（10∶90，V/V）為流動相等度洗脫模式下，也可實現3種氨基糖苷類抗生素的分離。但以TSKgel Amide-80色譜柱分離的色譜圖不理想，目標物峰形有展寬和拖尾現象；而以陽離子極性與非極性混合作用機理模式的Sielc Obelisc R色譜柱上目標組分的分離色譜圖效果較好，各組分有較好的分離度，故最終采用Sielc Obelisc R色譜柱。

2.1.2 流動相的選擇

采用Sielc Obelisc R色譜柱分離，不同流動相等度洗脫對3種氨基糖苷類抗生素回收率的影響見圖2。

圖2 3種流動相對3種氨基糖苷類抗生素回收率的影響Fig. 2 Effect of 3 kinds of mobile phase on recovery of 3 aminoglycoside antibiotics

由圖2可知，3種流動相中1.0%甲酸水溶液-乙腈（10∶90，V/V）洗脫效果最好，3種AGs均能被洗脫，這是由于AGs包含多個氨基結構，屬于堿性糖苷，酸性洗脫液易與氨基糖苷類結合，所以1.0%甲酸水溶液-乙腈（10∶90，V/V）洗脫得到的各分析物回收率高于水-乙腈（10∶90，V/V）洗脫。進一步優化甲酸水溶液-乙腈（10∶90，V/V）流動相體系中甲酸含量對洗脫效率的影響，分別用0.05%～1.00%甲酸水溶液-乙腈（10∶90，V/V）進行洗脫，計算3種氨基糖苷類抗生素的回收率，結果見圖3。

圖3 流動相中甲酸含量對3種氨基糖苷類抗生素回收率的影響Fig. 3 Effect of formic acid content in mobile phase on recovery of 3 aminoglycoside antibiotics

由圖3可知，流動相采用0.10%甲酸水溶液-乙腈（10∶90，V/V）洗脫時，各分析物的回收效果最好，回收率范圍為79.1%～92.6%。因此，確定最優的流動相為0.10%甲酸水溶液-乙腈。

2.1.3 基質效應的影響

為了減少質譜分析時的基質效應，盡量除去動物源運動食品中的干擾物質，方法采用乙腈-甲酸溶液梯度淋洗以去除干擾物質[21-25]。收集每段淋洗液進樣檢測，最終確定最優流動相及其梯度洗脫程序見表2。

表2 流動相梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program of mobile phase

2.2 方法學驗證

2.2.1 標準曲線的制作

在最優色譜條件下檢測3種氨基酸糖苷類抗生素標準品，繪制標準曲線，確定檢出限及定量限，結果見表3。

表3 3種氨基糖苷類抗生素的保留時間、標準曲線、相關系數、檢出限與定量限Table 3 Retention time, standard curve, correlation coefficient, limit of detection and quantification of 3 aminoglycoside antibiotics

由表3可知，3種AGs線性關系良好，相關系數（R2）在0.999 5～0.999 9之間，方法的檢出限均為15 μg/kg，定量限均為50 μg/kg。

2.2.2 穩定性與重復性

在最優條件下，潮霉素B、安普霉素和新霉素保留時間的日間和日內RSD分別為3.5%～7.9%和3.5%～4.1%；峰面積的日間和日內RSD分別為3.6%～7.4%和3.2%～3.9%，說明該方法的穩定性和重復性均良好。

2.2.3 加標回收率實驗

在最優條件下，潮霉素B、安普霉素和新霉素的加標回收率實驗結果見表4。

表4 方法的回收率及相對標準偏差（n=5）Table 4 Recoveries and relative standard deviation of the method (n=5)

由表4可知，3種AGs平均加標回收率在85.7%～93.6%，回收率實驗結果的相對標準偏差（RSD）為3.1%～5.2%，可以滿足檢測方法的要求。

2.3 實際樣品的檢測

將本方法應用于從超市中隨機抽取的5種品牌共10份動物源運動食品樣品，檢測3種AGs的殘留。結果顯示樣品中3種AGs的含量均低于50μg/kg，均滿足國家標準GB31650—2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》中的限量要求。

3 結論

本研究通過對4種HILIC色譜柱比較和MSPD條件的優化，建立了親水交互作用色譜-串聯質譜法測定動物源運動食品中3種AGs殘留的分析方法，即樣品經Sielc Obelisc R柱分離，采用0.10%甲酸水溶液-乙腈梯度洗脫。采用該方法3種化合物組分在5～500 ng/mL的質量濃度范圍內具有良好的線性關系，相關系數R2為0.999 5～0.999 9，檢出限均為15 μg/kg，定量限均為50 μg/kg，保留時間的日間和日內RSD分別為3.5%～7.9%和3.5%～4.1%，峰面積的日間和日內RSD分別為3.6%～7.4%和3.2%～3.9%，說明該方法的穩定性和重復性均良好。加標回收率為85.7%～93.6%，回收率試驗結果的RSD為3.1%～5.2%。本方法靈敏度高，重現性好，有效解決了檢測氨基糖苷類抗生素時反相色譜柱上保留性能不佳、回收率低的分析難點，可為動物源運動食品中3種AGs殘留的分析和監控提供技術支持。