黑枸杞果醋發酵工藝條件優化

齊海麗，呂云皓，楊雙銘，江 英*

（1.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000；2.瑪納斯縣眾甲食品有限公司，新疆 瑪納斯 832200）

黑枸杞（Lycium ruthenicumMurr）屬茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）落葉多棘刺灌木，是一種藥食同源的特色植物[1-2]，主要分布于中國陜西北部、寧夏、甘肅、青海、新疆和西藏等地[3-4]，因其果實具有獨特的營養價值和保健功能而廣為人知[5]?！毒S吾爾藥志》中記載，黑枸杞果實及根皮對皮膚病、尿道結石、齒齦出血等癥有一定的治療效果，民間則用作明目、降壓以及滋補強壯藥[6-7]。黑枸杞主要的化學成分是花青素，具有抗氧化作用，可防止過早衰老，增強血管彈性，抑制過敏及炎癥，改善關節柔韌性等功效[8-9]。近些年人們對保健食品、藥品越來越重視，黑枸杞因具有豐富的營養價值，又具有資源可再生等優點，其需求量也逐年上漲，廣泛應用于功能性食品以及保健藥品制備行業[10]。

果醋一般是以水果為原料，經酶解處理、酒精發酵和醋酸發酵而成的一種營養豐富的酸性調味品，富含維生素、氨基酸和碳水化合物，能夠補充人體所需的營養物質[11-13]。黑枸杞作為一種藥食同源的小漿果類保健品，目前對其生理活性的研究是重點[14]，而對其產品的研發鮮有報道，目前黑枸杞產品多為與其他水果復合而來的果汁、果酒和果醋，使黑枸杞的口感、風味等特性無法得到充分體現[15]。黑枸杞果醋是以黑枸杞干果為主要原料，經酒精發酵、醋酸發酵釀制而成的酸性飲品。它兼具黑枸杞和一般果醋的營養生理功能，極大地改善了醋的口感，是一種時興新型保健飲品[16]。本研究以黑枸杞為原料制備果醋，采用液態發酵方法，在單因素試驗的基礎上，利用正交設計和響應面法優化其酒精發酵和醋酸發酵工藝條件，為黑枸杞果醋的產業化開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑枸杞干果：市售；安琪釀酒酵母、葡萄酒果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；AS1.41型醋酸菌：上海佳民釀造食品有限公司；滬釀1.01醋酸菌：山東和眾康源生物科技有限公司；葡萄糖（分析純）：天津盛奧化學試劑有限公司；偏重亞硫酸鉀（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；維生素C（分析純）：天津市永大化學試劑開發中心；果膠酶（30 000 U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

VP30型榨汁機：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；L3S分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；B250智能數顯恒溫油水浴鍋：上海予卓儀器有限公司；RE-3000旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；WYTO-18型手持式糖度計：成都泰華光學有限公司；HT-24X2H恒溫振蕩培養器：上海五久自動化設備有限公司；SW-CJ-1C無菌工作臺：無錫一凈凈化設備有限公司；雷磁PHS-25型酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；FRESCO-21離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑枸杞果醋加工工藝流程及操作要點

操作要點：

清洗、復水：對去除果柄泥渣后的黑枸杞干果進行稱質量，清洗后加入蒸餾水，30 ℃浸泡1 h進行復水處理，直至干果柔軟無硬心。

打漿、酶解：使用榨汁機將復水處理后的黑枸杞打漿30 s，加入0.4%的果膠酶，置于40 ℃酶解1 h。

過濾、調配、殺菌：使用8層紗布過濾，添加白砂糖調節黑枸杞漿液糖度。于75 ℃維持30 s，然后迅速冷卻降溫。

酵母菌活化、接種：稱取適量的酵母菌，加入10倍的蒸餾水，混勻后加入8%的白砂糖，充分攪拌，使白砂糖溶解，在35 ℃下活化30 min，再加入適量黑枸杞漿液，繼續在35 ℃下馴化15 min，得活化酵母液。將4%活化酵母菌接種到殺菌后的黑枸杞漿中。

酒精發酵：在一定溫度下發酵，每天定時測其酒精度。當發酵醪液表面氣泡消散，酵母泥沉積在瓶底，且酒精度2 d內不再變化時，酒精發酵結束，得到黑枸杞酒液。

過濾、殺菌：使用八層紗布過濾掉酵母泥，于65 ℃維持30 min殺菌。

醋酸菌活化、接種：稱取適量的醋酸發酵菌種，加入10倍的酒精度為4%vol～5%vol的酒精，30 ℃、110 r/min振蕩培養12 h，加入適量黑枸杞酒液及在30 ℃馴化12 h的活化醋酸菌液。將6%活化醋酸菌接種到黑枸杞酒液中。

醋酸發酵：于30 ℃、120 r/min振蕩培養條件下發酵，每天定時取樣，檢測其酒精度和酸度，7 d左右醋酸菌將乙醇轉化為乙酸，當酒精度不再下降、酸度不再上升時，表明醋酸發酵基本結束。

澄清、離心：加入0.2%的食鹽抑制醋酸菌的活性，后加入5 g/L的殼聚糖，澄清8 h，于3 000 r/min離心10 min。

滅菌、裝罐：將上清液灌裝到瓶子里，于121 ℃超高溫滅菌10 min，封蓋后即得黑枸杞果醋。

1.3.2 酵母菌的選擇

處理兩份相同的黑枸杞漿液，分別接種葡萄酒釀酒酵母和安琪釀酒酵母（接種量4%），按照1.3.1節工藝進行酒精發酵，通過考察酒精度的變化，來確定最佳酵母菌種類。

1.3.3 酒精發酵工藝優化

單因素試驗：分別設置黑枸杞干果添加量為5%、10%、15%、20%、25%，初始糖度為9%、11%、13%、15%、17%，發酵溫度為26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃，酵母接種量為2%、3%、4%、5%、6%，進行酒精發酵，以酒精度為評價指標，確定最適的黑枸杞干果添加量、初始糖度、發酵溫度及酵母接種量。

正交試驗：以酒精度為評價指標，固定黑枸杞干果添加量為15%，以初始糖度（A）、發酵溫度（B）、接種量（C）為影響因素，采用3因素3水平正交設計，黑枸杞果醋酒精發酵工藝優化正交試驗因素與水平見表1。

表1 酒精發酵工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for technology optimization of alcoholic fermentation

1.3.4 醋酸菌的選擇

處理兩份相同的黑枸杞酒液，分別接種滬釀1.01醋酸菌和AS1.41型醋酸菌（接種量6%），按照1.3.1節工藝進行醋酸發酵，通過考察酸度的變化，以確定最佳醋酸菌種類。

1.3.5 醋酸發酵工藝優化

單因素試驗：以酸度為評價指標，分別考察發酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）、裝液量（20 mL/250 mL、30 mL/250 mL、40 mL/250 mL、50 mL/250 mL、60 mL/250 mL）對醋酸發酵的影響。

響應面試驗設計：固定搖床轉速為120 r/min，發酵時間為7 d，以酸度為評價指標，以發酵溫度（A）、接種量（B）、裝液量（C）為影響因素，采用3因素3水平的響應面法優化醋酸發酵工藝，響應面試驗因素與水平見表2。

表2 醋酸發酵工藝優化響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for technology optimization of acetic fermentation

1.3.6 黑枸杞果醋感官評價

參考農業行業標準NY/T2987—2016《綠色食品果醋飲料》[17]，以色澤（15分）、香氣（30分）和滋味（40分）及組織狀態（15分）作為感官評價項目，滿分100分，制定黑枸杞果醋的感官質量評定標準見表3。

表3 黑枸杞果醋的感官評定標準Table 3 Sensory evaluation standards of Lycium ruthenicum vinegar

1.3.7 理化指標的測定

pH值：采用pH計測定；可溶性固形物：采用手持式糖度計測定；總酸（以醋酸計）：采用酸堿中和滴定法[18]測定；酒精度：采用蒸餾法[19]測定；花青素含量：采用pH示差法[20]測定。

1.3.8 數據處理

單因素試驗數據利用Origin 8.5軟件處理軟件進行處理和分析；響應面優化設計分析利用Design-Expert V10.0.1設計軟件；顯著性差異分析采用SPSS17.0統計軟件進行，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的選擇

由圖1可知，使用葡萄酒果酒酵母發酵的酒精度遠遠高于安琪釀酒酵母，且葡萄酒果酒酵母的發酵周期短，在第6天時，葡萄酒果酒酵母的發酵趨勢已經平緩，酒精度達到7.1%vol左右，而安琪釀酒酵母在第8天時仍處于上升趨勢，且酒精度只達到5%vol。因此，葡萄酒果酒酵母為最適菌種。

圖1 酵母菌種類對酒精度的影響Fig. 1 Effect of yeast species on alcohol content

2.2 黑枸杞果醋酒精發酵工藝優化

2.2.1 黑枸杞干果添加量的確定

由圖2可知，當黑枸杞干果添加量越高時，其酒精度越低，這是由于漿液中的含糖量是固定的，此時漿液過于濃稠，酵母菌快速生長，產生的酒精過多，酒精又抑制酵母菌的生長，導致酵母菌發酵遲緩，最終導致酒精度處于較低的狀態。在黑枸杞干果添加量＜15%時，酒精度增長較快，且酒精度相對較高，但此時黑枸杞果酒的色澤偏淡，透光率極大，且口感寡淡，黑枸杞的特色風味沒有體現出來；當黑枸杞干果添加量為15%時，果酒的清香風味和黑枸杞的特色風味融合在一起，具有宜人的色澤和口感；當黑枸杞干果添加量＞15%之后，酒精度的增長趨勢有所減緩，這是由于發酵液中的糖度過高，酵母菌無法完全利用，反而抑制了酵母菌的生長。因此，最適黑枸杞干果添加量為15%。

圖2 黑枸杞干果添加量對酒精度的影響Fig. 2 Effects of dried fruit of Lycium ruthenicum addition on alcohol content

2.2.2 初始糖度的確定

糖分是酵母菌生長的主要營養物質，糖度含量對酒精量的產生有一定的影響[21]。由圖3可知，當初始糖度為9%～13%時，酒精量的增長處于一個較為平緩的趨勢，產生的酒精量也不高；當初始糖度為15%時，酒精量的增長速度最快且在第4天時達到了最高值；當初始糖度為17%時，酒精度的增長趨勢有所減緩，這是由于發酵液中的糖度過高，酵母菌無法完全利用，反而抑制了酵母菌的生長。因此，最適初始糖度為15%。

圖3 初始糖度對酒精度的影響Fig. 3 Effect of initial sugar contents on alcohol content

2.2.3 發酵溫度的確定

發酵溫度是影響微生物發酵的重要外界因素，可以顯著影響菌體的生長狀況，進而影響酒精量的產生[22]。由圖4可知，當發酵溫度為26～30 ℃時，酒精發酵速率一直較為緩慢；當發酵溫度為30 ℃時酒精發酵速率明顯比其他溫度下發酵的要高；當發酵溫度＞30 ℃時，酒精發酵速率前期速度較快，后期逐漸變緩；較低的培養溫度使菌種增殖緩慢，酒精度低，發酵不完全。溫度過高可縮短發酵周期，促使酵母菌提前進入衰亡期，影響發酵汁中菌體數量與酒精度。因此，最適發酵溫度為30 ℃。

圖4 發酵溫度對酒精度的影響Fig. 4 Effect of fermentation temperature on alcohol content

2.2.4 酵母接種量的確定

由圖5可知，當酵母接種量為2%～4%時，起酵速度慢，體系中所產酒精量也慢；當酵母接種量為4%時，發酵速度快，發酵的啟動速度也在加快，體系中所產酒精度也較高；當酵母接種量＞4%之后，當發酵速度較早達到頂峰時，由于酵母有自溶、衰亡等現象，使發酵速度逐漸下降，產酒精量隨之下降[23]。因此，最適酵母接種量為4%。

圖5 酵母接種量對酒精度的影響Fig. 5 Effect of yeast inoculum on alcohol content

2.3 酒精發酵工藝優化正交試驗

根據酒精發酵單因素試驗，固定黑枸杞干果添加量為15%，考察初始糖度（A）、發酵溫度（B）、酵母接種量（C）對黑枸杞果醋酒精發酵工藝的影響。正交試驗結果與分析見表4。

表4 酒精發酵工藝優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for technology optimization of alcoholic fermentation

由表4可知，影響酒精度因素主次為A＞C＞B，即初始糖度＞酵母接種量＞發酵溫度。最優酒精發酵工藝組合為A3B3C2，即初始糖度為17%，發酵溫度為32 ℃，接種量為4%。在此最佳條件下進行3次平行驗證試驗，酒精度平均值為7.4%vol。

2.4 醋酸菌的選擇

由圖6可知，滬釀1.01醋酸菌的酸度上升趨勢高于AS1.41型醋酸菌，醋酸生成量高于AS1.41型醋酸菌，由此說明，滬釀1.01醋酸菌的醋酸發酵效果遠高于AS1.41型醋酸菌。因此，最適醋酸菌為滬釀1.01。

圖6 不同醋酸菌對酸度的影響Fig. 6 Effect of different acetic acid bacteria on acidity

2.5 黑枸杞果醋醋酸發酵工藝優化

2.5.1 發酵溫度的確定

由圖7可知，當發酵溫度為26～30 ℃時，黑枸杞醋酸發酵液中總酸含量較低，這可能是因為溫度較低時醋酸菌活性較弱所致；當發酵溫度為30 ℃時，總酸含量最高；當發酵溫度＞30 ℃之后，總酸含量反而下降，這可能是因為溫度較高，醋酸菌生長和代謝過于旺盛，菌體極易老化、衰退，而且高溫不利于產物的積累[24]。因此，最適發酵溫度為30 ℃。

圖7 發酵溫度對酸度的影響Fig. 7 Effect of fermentation temperature on acidity

2.5.2 接種量的確定

由圖8可知，當接種量為2%～6%時，產酸速度較慢，發酵周期較長，最終的總酸含量也較低；隨著接種量的増加，產酸速度增大，發酵周期縮短，總酸含量增大，且在接種量為6%時，發酵周期僅為4 d，總酸含量達最大值3.75 g/100 mL；當接種量＞6%之后，發酵周期不斷縮短，但總酸含量呈明顯下降趨勢，接種量過大，菌體增殖會消耗發酵液中大部分養分，并且積累大量代謝廢物，導致醋酸菌過早出現老化、自溶現象，影響醋酸發酵效果[25]。因此，最適接種量為6%。

圖8 接種量對酸度的影響Fig. 8 Effect of inoculum on acidity

2.5.3 裝液量的確定

由圖9可知，當裝液量為20～40 mL/250 mL時，漿液中溶氧過量，易引發醋酸菌死亡，影響黑枸杞發酵液中總酸含量；當裝液量為40 mL/250 mL時，黑枸杞發酵液中總酸含量最高；當裝液量＞40 mL/250 mL之后，漿液中溶氧量不足，不利于菌體的生長及氧化酒精過程的進行[26]。因此，選擇最適裝液量為40 mL/250 mL。

圖9 裝液量對酸度的影響Fig. 9 Effect of liquid volume on acidity

2.6 響應面法優化醋酸發酵工藝條件

在單因素試驗分析結果的基礎上，以酸度（Y）為響應值，固定搖床轉速為120 r/min，發酵時間為7 d，考察發酵溫度（A）、接種量（B）、裝液量（C）對黑枸杞果醋醋酸發酵工藝的影響，采用Design-Expert V10.0.1軟件進行3因素3水平的響應面設計，將得到的試驗數據進行二次多項回歸擬合，試驗均重復3次。響應面試驗設計結果見表5，方差分析結果見表6。

應用Design-Expert V 10.0.1軟件對表5的試驗數據進行回歸分析，得酸度回歸方程如下：

表5 響應面試驗設計與結果Table 5 Design and results of response surface experiments

由表6可知，該模型P＜0.01，回歸模型方程顯著；失擬項P=0.199 9＞0.05，不顯著，表明該方程合理可行；決定系數R2=0.928 3，校正決定系數R2Adj=0.836 1，說明該模型能解釋83.61%響應值的變化。該回歸方程的擬合度和可信度均較好，可用于黑枸杞果醋醋酸發酵的理論預測。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

模型方程的一次項C、交互項AB對結果有顯著的影響（P＜0.05），一次項B、二次項B2、C2對結果有極顯著的影響（P＜0.01）。由F值可知，各因素對醋酸產量影響的大小順序為：發酵溫度（A）＞裝液量（C）＞接種量（B）。

由圖10可知，酸度隨著發酵溫度和接種量的增加呈現先升高后下降的趨勢，兩者等高線呈現橢圓形，存在極值，且坡度較陡說明交互作用顯著；隨著發酵溫度和裝液量的增加，酸度呈現出先升高后下降的趨勢，且坡度較平緩交互作用不顯著；隨著接種量和裝液量的增加，酸度呈現出先升高后下降的趨勢，坡度相對較陡，交互作用較顯著。

圖10 發酵溫度、接種量和裝液量交互作用對黑枸杞果醋酸度影響的響應面及等高線Fig. 10 Response surface plots and contour lines of interaction between fermentation temperature, inoculum and liquid volume on Lycium ruthenicum fermentation

通過統計軟件Design-Expert V 10.0.1對模型優化求解，得到黑枸杞果醋醋酸發酵的最佳工藝條件為：發酵溫度30.472 ℃，接種量6.809%，裝液量42.023 mL/250 mL，此條件下發酵后黑枸杞果醋酸度理論值為3.771 g/100 mL。

為驗證試驗結果的真實性，考慮實際的操作情況，將發酵工藝參數調整為發酵溫度30 ℃，接種量7%，裝液量42 mL/250 mL，在此最佳醋酸發酵工藝條件下進行3次驗證試驗，得到黑枸杞果醋的酸度實際值為3.763 g/100 mL，結果與預測值相差微小。因此，采用響應面法優化的黑枸杞果醋發酵工藝條件準確可靠，具有可行性。

2.7 產品的質量指標

對優化配方后的黑枸杞果醋進行感官分析，色澤呈紫色，色澤純正均勻；具有果醋香氣和黑枸杞的氣味；酸度適中，口感較好；穩定性好，無肉眼可見雜質。

對優化配方后的黑枸杞果醋進行理化指標的測定，pH值為4.5；可溶性固形物含量為9.0%；總酸含量為（以醋酸計）3.76 g/100 mL；花青素含量為0.548 g/100 mL。

3 結論

依據單因素試驗結果和正交試驗確定最佳黑枸杞果醋酒精發酵工藝為初始糖度為17%、發酵溫度為32 ℃、接種量為4%。通過單因素及響應面優化得到黑枸杞果醋醋酸的最優發酵工藝為發酵溫度30 ℃、接種量為7%、裝液量為42 mL/250 mL。黑枸杞果醋飲料色澤深紫、賦有光澤，口感好、酸度適中、爽口、無異味，具有濃郁的醋香和黑枸杞的清香、柔和、刺激味少，澄清、無沉淀、無懸浮物。